xiaoyulei01 发表于 2010-11-8 15:52

HIV/AIDS实验室检测及其研究进展

找到一篇文章 上面说 四代窗口期2-3周 相比第三代检测窗口期平均缩短4-5天,希望对大家有帮助!

胖猪 发表于 2010-11-8 16:48

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xiaoyulei01 发表于 2010-11-8 20:38

HIV/AIDS实验室检测及其研究进展
白 浪 雷秉钧
四川大学华西医院感染性疾病中心(成都 610041)
摘要 获得性免疫缺陷综合征(AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的一种严重危胁人类健康的传染病。
实验室检测是诊断HIV/AIDS 的主要依据。HIV 实验室检测一般包括病毒抗体和抗原检测、病毒核酸检测、免疫细
胞检测及病毒耐药检测。20 多年来,HIV 的实验室诊断方法取得很大进展,特别是近年来免疫学方法和分子生物学
方法的应用为临床诊治和流行病学调查提供了有力的帮助。对HIV 的检测,灵敏度及特异度高的分析方法将有助
于HIV 的早期诊断、避免漏检,也有助于对抗艾滋病药物的疗效评价、预测和监测疾病进程,提高检测的灵敏性,缩
短检测的窗口期,是HIV 诊断方法和诊断试剂持续发展的主要方向。随着对HIV/AIDS 研究的不断深入及分子生
物学技术的飞速发展,各种检测HIV 的新技术层出不穷,HIV 的实验室检测正朝着简便、快速、敏感、准确及自动化
方向发展。
1 HIV抗体检测
HIV 抗体检测分为初筛实验和确认实验,前者包括酶联
免疫吸附试验、凝胶颗粒凝集试验、乳胶凝集试验、放射免疫
试验和各种快速检测试验等。后者包括免疫印迹法、免疫荧
光法、条带免疫试验和放射免疫沉淀试验等。
1.1 初筛试验
1.1.1 酶联免疫吸附试验(ELISA) 为检测HIV 抗体的最
主要方法,是最常用的HIV 抗体筛查试验。其试剂已经发展
到第4 代。1985 年,美国FDA 批准使用第1 代ELISA 检
测试剂,主要应用于献血员的筛查。第1 代试剂主要以病毒
裂解物或部分纯化的病毒抗原包被反应板,由于含有宿主细
胞成分的污染和杂蛋白的存在,故假阳性较高。曾有学者对
8 种主要的HIV 诊断试剂进行评估,最差的敏感度和特异度
分别为97.2% 和70.0%。上世纪80 年代中后期,基因工程
技术迅速发展,这给除病毒培养以外获得HIV 抗原提供了新
途径。1990 年,采用基因工程重组或人工合成肽为抗原的第
2 代试剂抗原组成一般包括p24、gp36、gp41、gp120,能同时
检测HIV-1、HIV-2 型。基因重组通常易于在培养基中产生
大量同源性抗原,产品为单一目的基因而非多样性抗原混合。
作者简介:白浪,男,讲师。
Email: pangbailang@163.com
中国循证医学杂志 2008, 8(3): 206~209
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实 践 与 交 流
因此,特异性较第1 代试剂有了很大提高,且检出的窗口期平
均比第1 代试剂缩短20.3 天。为进一步提高试剂的敏感性,
1994 年发展了第3 代试剂,由于第3 代使用双抗原夹心法检
测抗体,能同时检出IgM 抗体,因此可以起到缩短窗口期的
作用。相对第2 代试剂检出HIV 抗体的时间可以提前4 ~ 5
天,同时敏感性有所提高, 假阳性率大约为0.26%。目前第
3 代试剂已成为我国目前使用的主流方法。第4 代试剂则在
第3 代试剂的基础上进一步增加了p24 抗原的检测。同时进
行HIV 抗体及p24 抗原的检测,可提高试剂敏感性,缩短窗
口期,减少急性感染者窗口期漏检。与第3 代试剂相比,第4
代试剂检测窗口期大约平均缩短4 ~ 5 天。但使用第4 代
试剂对HIV 病毒进行检测,仍有2 ~ 3 周的窗口期。此外,
由于抗原和抗体同时包被在反应板上,存在相互干扰的可能,
影响了免疫反应的特异性。一般来讲,使用第4 代试剂检测
p24 抗原,其灵敏度(20 ~ 100 pg/ml)远远低于单独检测抗
原抗体分析法(3.5 ~ 10 pg/ml)。从方法学上来讲,这种基
于ELISA 的分析方法,灵敏度终归有限,相对化学发光和时间
分辨荧光免疫分析技术等更先进的分析方法,其灵敏度较低。
再加上成本提高等因素,第4 代试剂要全面取代第3 代试剂
尚有待进一步的评估和考证。
1.1.2 快速检测试验(RT) 目前对HIV 检测试剂,既需要
较高的敏感性和特异性,同时也要求其更简便快速。目前已
有凝胶颗粒凝集试验,免疫斑点印迹等方法。
1.1.2.1 凝胶颗粒凝集试验(PA) 它是通过包被HIV 抗原
的颗粒凝集来检测抗体的存在。标本中的抗体与颗粒载体上
的HIV 抗原结合带动载体颗粒的凝集,出现肉眼可见的凝集
现象。PA 是一种快速简便的筛查试验,整个过程不需洗涤,
不用任何仪器,一般10 ~ 60 min 就会得到结果,很适合少量
标本检测。但由于其灵敏度和特异度不及ELISA,故不宜用
于献血员和大规模常规检测。
1.1.2.2 免疫斑点试验 通常使用硝酸纤维膜作为固相载
体,将HIV 抗原包被在膜上。若待测血清中存在HIV 抗体即
可与包被的抗原结合,然后该复合物可与酶标记的抗人免疫
球蛋白结合,再加入底物时在膜上就可以出现肉眼可见的着
色斑点。通常在膜下有一塑料衬底,还有一个吸收垫以吸收
样品和试剂。此种试验一般需要加入洗液、底物等液体,完成
操作需要数个步骤,价格也高于免疫层析剂。
1.1.2.3 免疫层析试验 在硝酸纤维素膜上预置胶体金标记
的基因重组HIV-1/2 抗原,同时分别在其下方的检测区包被
基因重组HIV-1/2 抗原,对照区包被兔抗HIV 单克隆抗体。
当样品加至纤维素膜上的样品孔后,样品中的HIV 抗体先与
胶体金标记的基因重组HIV-1/2 抗原结合形成复合物。由于
层析作用复合物沿硝酸纤维素膜移动,到达检测区时则与包
被于其上的基因重组HIV-1/2 抗原形成双抗原夹心免疫复合
物,显色出现肉眼可见的红色条带;未与HIV 抗体结合的游
离胶体金标记的基因重组HIV-1/2 抗原则继续移动,在对照
区与兔的抗HIV 单克隆抗体结合,出现另一条红色条带作为
质控。出现两条阳性带则表示样品中有抗HIV 抗体存在,判
为阳性。若为阴性样品,则检测区不出现红色条带,仅在对照
区形成一条红线。免疫层析试验还可在固相载体的不同部位
包被不同的抗原来检测HIV-1M 亚型及O 亚型。虽然免
疫层析试验灵敏度不及酶联免疫吸附试验。但由于该法
具有试剂无需冷藏、步骤简捷、无需任何仪器设备及容易解释
结果等特点,适合于基层实验室筛查使用。
1.1.2.4 艾滋病唾液检测卡(萨丽卡,Salivacard) 在萨丽卡
的硝酸纤维膜基质上包被人工合成的HIV gp41/ gp36 蛋白抗
原,可同时检测含在唾液中的HIV-1/HIV-2 抗体。主要检测
唾液中的HIV IgA 与IgG 抗体,敏感性及特异性与ELISA 相
近,避免静脉穿刺。但标本预处理时间长且售价昂贵。以唾
液为标本测定HIV 抗体的EIA、WB 试剂已获得美国FDA 批
准。
1.1.3 尿液HIV 抗体检测 尿液检测已成为艾滋病检测的
一种全新手段,在安全、便捷等方面更具优势。HIV 感染者
的尿液、唾液、精液及泪液中均含有HIV 抗体,其HIV 抗体
主要成分为IgG。1996 年美国FDA 首次批准HIV-1 尿液
EIA 试剂。国内赵立关等 进行的一项尿液试剂评价中,
CalypteTM 尿液试剂盒ELISA 法的灵敏度达100%,特异度达
99.1%,与确认结果比较阳性符合率为100%。
1.2 确认试验
鉴于各种抗HIV 的初筛试验均有不同程度的假阳性。
而HIV 感染的诊断,无论对患者或社会均至关重要,诊断要
求高度准确性,故对初筛试验阳性者必须应用特异性更高的
确认试验进行确定。
1.2.1 免疫印迹法 就HIV 的病原学诊断而言,WB 的检测
结果常常被作为鉴别其它检测方法优劣的“金标准”,因此它
是HIV 感染的确认试验方法,也是我国卫生部颁布的《艾滋
病检测技术规范》中规定的唯一的HIV 感染确认方法。WB
的敏感性和特异性均高于ELISA 法。其假阳性率低于1/2 万,
假阴性率约为1/25 万。其较高的特异性主要基于HIV 不同
抗原组分的分离以及浓缩和纯化。由于能够同时检测多种抗
体以及对阳性判定的要求必须有两条以上的条带出现,因而
能够用WB 方法鉴别初筛试验的假阳性结果。不过该方法比
较昂贵,技术要求高,影响因素多,操作不当和误判带型的假
阳性率>2%。另外,文献报道大约4% ~ 20% 的样品经过
HIV 初筛复检阳性后,WB 结果为“不确定”。相当数量的“不
确定”样品与p24 条带有关。一种可能的解释是与非特异性
抗体有关。因此,对试验结果的判定需要经验和审慎。
1.2.2 免疫荧光 将HIV 感染的细胞作为抗原固定在玻片
上,再在其上滴加待检血清,若含有HIV 抗体,则与细胞膜上
的病毒抗原结合,清洗后加荧光标记的抗人IgG,若阳性即可
将细胞膜染色。此法操作简便,敏感性及特异性均较ELISA
法高,但存在对某些血清非特异性荧光难以去除,结果判断需
较高级的荧光显微镜等缺点。
1.2.3 放射免疫沉淀试验 用同位素标记的HIV 蛋白与待
检血清反应,若血清中含有HIV 抗体即可与HIV 蛋白抗原
结合,再加入葡萄球菌蛋白A,经低速离心,然后将沉淀复合
物分离后电泳,放射自显影观察同位素标记蛋白带即可判定。
本法灵敏度和特异度均好,但因试剂制备复杂,成本高,且同
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Practice and Communication
位素操作需要严格防护而限制其应用。
2 HIV-1 p24抗原检测
HIV-1 p24 抗原检测可用于HIV-1 抗体不确定或窗口期
的辅助诊断,HIV-1 抗体阳性母亲所生婴儿早期的辅助鉴别
诊断,以及第4 代ELISA 诊断试剂检测呈阳性,但确认试验阴
性者的辅助诊断。目前一般采用EIA 双抗体夹心法测定HIV
感染者或AIDS 病人血液中的p24 蛋白。此法灵敏度较差,
约50% ~ 80%。因此该结果仅作为HIV 感染的辅助诊断
依据,不能据此确诊。
为提高p24 抗原检出率,其检测技术目前已有较大
发展。包括免疫复合物裂解检测法(immune complex
dissociation,ICD),超敏感酶免疫测定法(ultrasensitive
enzyme immunoassay,UEI),线性免疫酶测定(l ineal
immunoenzymatic assay,LIA)等一系列新技术。其中ICD 的
敏感性已提高到90%,而LIA 最敏感的抗原检测试剂盒的
检测阈值为0.01 pg/ml。
3 HIV核酸测定
此方法是目前最为敏感的HIV 检测方法。常用测
定HIV RNA 拷贝数,称之为病毒载量,感染HIV 后病情发
展速度直接与血浆中病毒载量呈正相关。HIV 病毒载量
通常在初期感染和艾滋病发病晚期最高,但在慢性潜伏期也
可检出。其测定方法大致上有逆转录多聚酶链反应(RT
– PCR)、分支DNA 信号放大系统(bDNA)、核酸序列依赖性
扩增(NASBA)和连接酶酶促链式反应(LCx)4 种。RT-PCR
法主要在RT 作用下HIV RNA 变成双链DNA 分子使引物与
各链DNA 结合,在DNA 合成酶作用下产生大量单链DNA。
经反复循环后使原有的HIV RNA 扩增底物大量产生,进行定
量测定。全自动PCR 检测系统将PCR 扩增反应和检测限制
在单个反应管中进行,避免了开放环境中对产物进行操作,因
此大大减少了污染的机会。使用自动化的敏感性为50 copy/
ml,特异性为99.6%,并可以对HIV-1 和HIV-2 的多个亚型
做出特异性的定量检测,自动化PCR 在检测HIV 载量方面
显示了极高的敏感性和可信度。bDNA 法是通过将捕捉
到的病毒基因信号扩增直接检测RNA。NASBA 法是裂解样
品中的病毒颗粒和细胞,释放出核酸,在其缓冲液中加入人工
合成的RNA 作为内部控制系统,在二氧化硅参与下,将野生
型RNA 与人工合成的RNA 同时扩增,检测两者扩增产物。
LCx 法应用2 套LCR 的探针、2 种酶和4 种核苷酸,将被检测
物中的特异性片段进行扩增,然后用MEIA 技术检测扩增产
物。最近,实时荧光PCR 检测技术的应用使HIV 核酸检测
技术又进入到一个新境界。采用该技术,既可检测血浆病毒
载量,也可以检测血浆中单个核细胞的前病毒载量。HIV
核酸测定,既可作为HIV 抗体窗口期的早期诊断,又可作为
婴儿经母婴传播感染的早期诊断,也是预测病情发展和药物
治疗效果评价的重要依据。病毒核酸检测方法尽管具有
很高的灵敏度,但由于HIV 基因的多样性,没有一套引物可
以覆盖所有的HIV 序列,使检测的敏感性又受到限制。此外
现有的病毒核酸检测方法其需要的检测仪器、检测试剂昂贵,
操作复杂,对操作人员要求高,既难以在一般实验室推广,又
不适用于对大量病人的快速检测,同样不适合基层广泛的临
床应用。

珍爱生命_521 发表于 2010-11-9 22:59

精神可嘉! 支持一下!

珍爱生命_521 发表于 2010-11-9 23:02

支持一下!   
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