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发表于 2010-11-8 20:38
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HIV/AIDS实验室检测及其研究进展
白 浪 雷秉钧
四川大学华西医院感染性疾病中心(成都 610041)
摘要 获得性免疫缺陷综合征(AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的一种严重危胁人类健康的传染病。
实验室检测是诊断HIV/AIDS 的主要依据。HIV 实验室检测一般包括病毒抗体和抗原检测、病毒核酸检测、免疫细
胞检测及病毒耐药检测。20 多年来,HIV 的实验室诊断方法取得很大进展,特别是近年来免疫学方法和分子生物学
方法的应用为临床诊治和流行病学调查提供了有力的帮助。对HIV 的检测,灵敏度及特异度高的分析方法将有助
于HIV 的早期诊断、避免漏检,也有助于对抗艾滋病药物的疗效评价、预测和监测疾病进程,提高检测的灵敏性,缩
短检测的窗口期,是HIV 诊断方法和诊断试剂持续发展的主要方向。随着对HIV/AIDS 研究的不断深入及分子生
物学技术的飞速发展,各种检测HIV 的新技术层出不穷,HIV 的实验室检测正朝着简便、快速、敏感、准确及自动化
方向发展。
1 HIV抗体检测
HIV 抗体检测分为初筛实验和确认实验,前者包括酶联
免疫吸附试验、凝胶颗粒凝集试验、乳胶凝集试验、放射免疫
试验和各种快速检测试验等。后者包括免疫印迹法、免疫荧
光法、条带免疫试验和放射免疫沉淀试验等。
1.1 初筛试验
1.1.1 酶联免疫吸附试验(ELISA) 为检测HIV 抗体的最
主要方法,是最常用的HIV 抗体筛查试验。其试剂已经发展
到第4 代[1-4]。1985 年,美国FDA 批准使用第1 代ELISA 检
测试剂,主要应用于献血员的筛查。第1 代试剂主要以病毒
裂解物或部分纯化的病毒抗原包被反应板,由于含有宿主细
胞成分的污染和杂蛋白的存在,故假阳性较高。曾有学者对
8 种主要的HIV 诊断试剂进行评估,最差的敏感度和特异度
分别为97.2% 和70.0%[5]。上世纪80 年代中后期,基因工程
技术迅速发展,这给除病毒培养以外获得HIV 抗原提供了新
途径。1990 年,采用基因工程重组或人工合成肽为抗原的第
2 代试剂抗原组成一般包括p24、gp36、gp41、gp120,能同时
检测HIV-1、HIV-2 型。基因重组通常易于在培养基中产生
大量同源性抗原,产品为单一目的基因而非多样性抗原混合。
作者简介:白浪,男,讲师。
Email: pangbailang@163.com
中国循证医学杂志 2008, 8(3): 206~209
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实 践 与 交 流
因此,特异性较第1 代试剂有了很大提高,且检出的窗口期平
均比第1 代试剂缩短20.3 天[6]。为进一步提高试剂的敏感性,
1994 年发展了第3 代试剂,由于第3 代使用双抗原夹心法检
测抗体,能同时检出IgM 抗体,因此可以起到缩短窗口期的
作用。相对第2 代试剂检出HIV 抗体的时间可以提前4 ~ 5
天,同时敏感性有所提高, 假阳性率大约为0.26%[7]。目前第
3 代试剂已成为我国目前使用的主流方法。第4 代试剂则在
第3 代试剂的基础上进一步增加了p24 抗原的检测。同时进
行HIV 抗体及p24 抗原的检测,可提高试剂敏感性,缩短窗
口期,减少急性感染者窗口期漏检。与第3 代试剂相比,第4
代试剂检测窗口期大约平均缩短4 ~ 5 天[8]。但使用第4 代
试剂对HIV 病毒进行检测,仍有2 ~ 3 周的窗口期。此外,
由于抗原和抗体同时包被在反应板上,存在相互干扰的可能,
影响了免疫反应的特异性。一般来讲,使用第4 代试剂检测
p24 抗原,其灵敏度(20 ~ 100 pg/ml)远远低于单独检测抗
原抗体分析法(3.5 ~ 10 pg/ml)[9]。从方法学上来讲,这种基
于ELISA 的分析方法,灵敏度终归有限,相对化学发光和时间
分辨荧光免疫分析技术等更先进的分析方法,其灵敏度较低。
再加上成本提高等因素,第4 代试剂要全面取代第3 代试剂
尚有待进一步的评估和考证。
1.1.2 快速检测试验(RT) 目前对HIV 检测试剂,既需要
较高的敏感性和特异性,同时也要求其更简便快速。目前已
有凝胶颗粒凝集试验,免疫斑点印迹等方法。
1.1.2.1 凝胶颗粒凝集试验(PA) 它是通过包被HIV 抗原
的颗粒凝集来检测抗体的存在。标本中的抗体与颗粒载体上
的HIV 抗原结合带动载体颗粒的凝集,出现肉眼可见的凝集
现象。PA 是一种快速简便的筛查试验,整个过程不需洗涤,
不用任何仪器,一般10 ~ 60 min 就会得到结果,很适合少量
标本检测。但由于其灵敏度和特异度不及ELISA,故不宜用
于献血员和大规模常规检测。
1.1.2.2 免疫斑点试验 通常使用硝酸纤维膜作为固相载
体,将HIV 抗原包被在膜上。若待测血清中存在HIV 抗体即
可与包被的抗原结合,然后该复合物可与酶标记的抗人免疫
球蛋白结合,再加入底物时在膜上就可以出现肉眼可见的着
色斑点。通常在膜下有一塑料衬底,还有一个吸收垫以吸收
样品和试剂。此种试验一般需要加入洗液、底物等液体,完成
操作需要数个步骤,价格也高于免疫层析剂。
1.1.2.3 免疫层析试验 在硝酸纤维素膜上预置胶体金标记
的基因重组HIV-1/2 抗原,同时分别在其下方的检测区包被
基因重组HIV-1/2 抗原,对照区包被兔抗HIV 单克隆抗体。
当样品加至纤维素膜上的样品孔后,样品中的HIV 抗体先与
胶体金标记的基因重组HIV-1/2 抗原结合形成复合物。由于
层析作用复合物沿硝酸纤维素膜移动,到达检测区时则与包
被于其上的基因重组HIV-1/2 抗原形成双抗原夹心免疫复合
物,显色出现肉眼可见的红色条带;未与HIV 抗体结合的游
离胶体金标记的基因重组HIV-1/2 抗原则继续移动,在对照
区与兔的抗HIV 单克隆抗体结合,出现另一条红色条带作为
质控。出现两条阳性带则表示样品中有抗HIV 抗体存在,判
为阳性。若为阴性样品,则检测区不出现红色条带,仅在对照
区形成一条红线。免疫层析试验还可在固相载体的不同部位
包被不同的抗原来检测HIV-1M 亚型及O 亚型[10]。虽然免
疫层析试验灵敏度不及酶联免疫吸附试验[11]。但由于该法
具有试剂无需冷藏、步骤简捷、无需任何仪器设备及容易解释
结果等特点,适合于基层实验室筛查使用。
1.1.2.4 艾滋病唾液检测卡(萨丽卡,Salivacard) 在萨丽卡
的硝酸纤维膜基质上包被人工合成的HIV gp41/ gp36 蛋白抗
原,可同时检测含在唾液中的HIV-1/HIV-2 抗体。主要检测
唾液中的HIV IgA 与IgG 抗体,敏感性及特异性与ELISA 相
近,避免静脉穿刺。但标本预处理时间长且售价昂贵。以唾
液为标本测定HIV 抗体的EIA、WB 试剂已获得美国FDA 批
准[12]。
1.1.3 尿液HIV 抗体检测 尿液检测已成为艾滋病检测的
一种全新手段,在安全、便捷等方面更具优势。HIV 感染者
的尿液、唾液、精液及泪液中均含有HIV 抗体,其HIV 抗体
主要成分为IgG[13]。1996 年美国FDA 首次批准HIV-1 尿液
EIA 试剂。国内赵立关等[14] 进行的一项尿液试剂评价中,
CalypteTM 尿液试剂盒ELISA 法的灵敏度达100%,特异度达
99.1%,与确认结果比较阳性符合率为100%。
1.2 确认试验
鉴于各种抗HIV 的初筛试验均有不同程度的假阳性。
而HIV 感染的诊断,无论对患者或社会均至关重要,诊断要
求高度准确性,故对初筛试验阳性者必须应用特异性更高的
确认试验进行确定。
1.2.1 免疫印迹法 就HIV 的病原学诊断而言,WB 的检测
结果常常被作为鉴别其它检测方法优劣的“金标准”,因此它
是HIV 感染的确认试验方法,也是我国卫生部颁布的《艾滋
病检测技术规范》中规定的唯一的HIV 感染确认方法。WB
的敏感性和特异性均高于ELISA 法。其假阳性率低于1/2 万,
假阴性率约为1/25 万。其较高的特异性主要基于HIV 不同
抗原组分的分离以及浓缩和纯化。由于能够同时检测多种抗
体以及对阳性判定的要求必须有两条以上的条带出现,因而
能够用WB 方法鉴别初筛试验的假阳性结果。不过该方法比
较昂贵,技术要求高,影响因素多,操作不当和误判带型的假
阳性率>2%[15]。另外,文献报道大约4% ~ 20% 的样品经过
HIV 初筛复检阳性后,WB 结果为“不确定”。相当数量的“不
确定”样品与p24 条带有关。一种可能的解释是与非特异性
抗体有关[16]。因此,对试验结果的判定需要经验和审慎。
1.2.2 免疫荧光 将HIV 感染的细胞作为抗原固定在玻片
上,再在其上滴加待检血清,若含有HIV 抗体,则与细胞膜上
的病毒抗原结合,清洗后加荧光标记的抗人IgG,若阳性即可
将细胞膜染色。此法操作简便,敏感性及特异性均较ELISA
法高,但存在对某些血清非特异性荧光难以去除,结果判断需
较高级的荧光显微镜等缺点。
1.2.3 放射免疫沉淀试验 用同位素标记的HIV 蛋白与待
检血清反应,若血清中含有HIV 抗体即可与HIV 蛋白抗原
结合,再加入葡萄球菌蛋白A,经低速离心,然后将沉淀复合
物分离后电泳,放射自显影观察同位素标记蛋白带即可判定。
本法灵敏度和特异度均好,但因试剂制备复杂,成本高,且同
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位素操作需要严格防护而限制其应用。
2 HIV-1 p24抗原检测
HIV-1 p24 抗原检测可用于HIV-1 抗体不确定或窗口期
的辅助诊断,HIV-1 抗体阳性母亲所生婴儿早期的辅助鉴别
诊断,以及第4 代ELISA 诊断试剂检测呈阳性,但确认试验阴
性者的辅助诊断。目前一般采用EIA 双抗体夹心法测定HIV
感染者或AIDS 病人血液中的p24 蛋白。此法灵敏度较差,
约50% ~ 80%[17]。因此该结果仅作为HIV 感染的辅助诊断
依据,不能据此确诊。
为提高p24 抗原检出率,其检测技术目前已有较大
发展。包括免疫复合物裂解检测法(immune complex
dissociation,ICD),超敏感酶免疫测定法(ultrasensitive
enzyme immunoassay,UEI),线性免疫酶测定(l ineal
immunoenzymatic assay,LIA)等一系列新技术。其中ICD 的
敏感性已提高到90%[18],而LIA 最敏感的抗原检测试剂盒的
检测阈值为0.01 pg/ml[19]。
3 HIV核酸测定
此方法是目前最为敏感的HIV 检测方法[20]。常用测
定HIV RNA 拷贝数,称之为病毒载量,感染HIV 后病情发
展速度直接与血浆中病毒载量呈正相关[21]。HIV 病毒载量
通常在初期感染和艾滋病发病晚期最高,但在慢性潜伏期也
可检出[22]。其测定方法大致上有逆转录多聚酶链反应(RT
– PCR)、分支DNA 信号放大系统(bDNA)、核酸序列依赖性
扩增(NASBA)和连接酶酶促链式反应(LCx)4 种。RT-PCR
法主要在RT 作用下HIV RNA 变成双链DNA 分子使引物与
各链DNA 结合,在DNA 合成酶作用下产生大量单链DNA。
经反复循环后使原有的HIV RNA 扩增底物大量产生,进行定
量测定。全自动PCR 检测系统将PCR 扩增反应和检测限制
在单个反应管中进行,避免了开放环境中对产物进行操作,因
此大大减少了污染的机会。使用自动化的敏感性为50 copy/
ml,特异性为99.6%,并可以对HIV-1 和HIV-2 的多个亚型
做出特异性的定量检测,自动化PCR 在检测HIV 载量方面
显示了极高的敏感性和可信度[23]。bDNA 法是通过将捕捉
到的病毒基因信号扩增直接检测RNA。NASBA 法是裂解样
品中的病毒颗粒和细胞,释放出核酸,在其缓冲液中加入人工
合成的RNA 作为内部控制系统,在二氧化硅参与下,将野生
型RNA 与人工合成的RNA 同时扩增,检测两者扩增产物。
LCx 法应用2 套LCR 的探针、2 种酶和4 种核苷酸,将被检测
物中的特异性片段进行扩增,然后用MEIA 技术检测扩增产
物。最近,实时荧光PCR 检测技术的应用使HIV 核酸检测
技术又进入到一个新境界。采用该技术,既可检测血浆病毒
载量,也可以检测血浆中单个核细胞的前病毒载量[24]。HIV
核酸测定,既可作为HIV 抗体窗口期的早期诊断,又可作为
婴儿经母婴传播感染的早期诊断,也是预测病情发展和药物
治疗效果评价的重要依据[25-26]。病毒核酸检测方法尽管具有
很高的灵敏度,但由于HIV 基因的多样性,没有一套引物可
以覆盖所有的HIV 序列,使检测的敏感性又受到限制。此外
现有的病毒核酸检测方法其需要的检测仪器、检测试剂昂贵,
操作复杂,对操作人员要求高,既难以在一般实验室推广,又
不适用于对大量病人的快速检测,同样不适合基层广泛的临
床应用。
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