HIV检测方法介绍：

尚允浩

HIV方法介绍：
http://www.nohiv.net/dispbbs.asp ... ID=14166&page=5
艾滋病的实验室检查

　　对艾滋病病人的特殊实验室检查包括针对HIV感染的检测和感染者及感染病毒状态的检查。针对HIV感染的检测包括对病毒及其成分的检测以及病毒感染后机体特异性的反应物(抗体、特异性免疫细胞等)的测定，对感染者及病毒状态的检查则包括病毒水平、生物学特性及作为病毒靶细胞和机体抵抗病毒的主要因素的免疫系统状况的检查。

　　目前作为诊断手段使用的检测主要包括抗HIV病毒抗体检测、病毒培养、核酸检测和抗原检测。其中对病毒抗体的检测是最常规使用的方法，这不但是由于这类检测特异性、敏感性较高，方法相对简便、成熟，更重要的原因是HIV抗体在病毒感染后除早期短暂的窗口期外的整个生命期间长期稳定地存在并可被检测到。在一些特殊情况下，当抗体检测无法满足HIV感染诊断的需要时，病毒分离及测定、核酸检测、抗原检测可作为辅助手段使用，这包括对非典型血清学反应样品的诊断、HIV感染的窗口期诊断、新生儿早期诊断和对特殊样品的诊断。 　　血清学检测
　　一、HIV抗体筛查
　　检测HIV抗体是常规使用的HIV病原学诊断方法。为了使检测结果达到尽可能高的准确性，HIV检测使用特殊的策略，即先用敏感性高的方法进行初筛，初筛阳性的标本再用特异性强的方法进行确认，同时，为了减少检测的错误和误差，还要采取严格的质量保证、质量控制和质量评价措施。

　　(一)HIV抗体的初筛检测--ELISA
　　HIV抗体初筛检测的方法很多，如酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、明胶颗粒凝集实验(gelatine particle agglutination assay，PA)、乳胶凝集实验(1atex agglutination assay，LA)、各种快速检测实验(rapid tests)、放射免疫实验(radio immunoassay)等。

　　目前使用最多的方法是ELISA法，其中间接法和双抗原夹心法最为常用。
　　二、快速试剂
　　(一)人类免疫缺陷病毒(HIV)1+2型抗体诊断试剂(胶体硒法)
　　雅培人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂(胶体硒法)是用于体外，肉眼观察，定性的免疫分析，检测血清或血浆中的HIV-1和HIV-2抗体，用于帮助受感染个体的HIV-1和HIV-2抗体。本品仅用于无偿献血员现场初筛及临床紧急情况的使用，本品检测阳性者，需进行进一步确证。

　　(二)InstantCHEKTM-HIVl+2金标快速诊断试剂
　　InstantCHEKTM-HIV1+2是一种快速、简单、灵敏的检验方法， 用以检测艾滋病病毒(HIV-1和HIV-2)的抗体。该方法适用于初筛检测，凡由该试剂测定为阳性者，需用另一种方法检测如ELISA或用蛋白印记法确定。
　　三、HIV-1抗体免疫印迹实验
　　免疫印迹实验(westernblot，WB)是广泛用于许多传染病诊断的实验方法，就HIV的病原学诊断而言，它是首选的用以确认HIV抗体的确认实验方法，WB的检测结果常常被作为鉴别其他检验方法优劣的“金标准”。

　　WB的敏感性一般不低于初筛实验，但它的特异性很高，这主要是基于HIV不同抗原组分的分离以及浓缩和纯化，能够检测针对不同抗原成分的抗体，因而能够用WB方法鉴别初筛实验的准确性。

　　WB技术主要包括3个部分：
　　①通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳将HIV抗原按照分子量大小而分离。
　　②将分离的抗原转移到硝酸纤维素膜上。
　　③加样检测标本中是否含有针对不同抗原组分的抗体。原理和操作类似于ELISA间接法。

　　四、免疫荧光实验(IFA)
　　IFA法经济、简便、快速，曾被FDA推荐用于WB不确定样品的诊断。但需要昂贵的荧光显微镜，需要受过良好训练的技术人员、观察和解释结果易受主观因素的影响，结果不宜长期保存，IFA不宜在一般的实验室开展和应用。

　　五、HIV抗原检测
　　在HIV感染的早期会出现一过性的抗原血症，此期间血浆中的病毒抗原是可能被检测到的，大多数感染者在随后相当长的一段时间内测不到抗原，在疾病晚期，随着免疫系统功能的丧失和病毒复制量的增加，部分患者可再次出现可检测到的抗原。HIV病毒抗原中最重要的成分是P24抗原，几乎所有的抗原检测都是针对P24设计的。

　　检测方法多为ELISA法，其中间接法较为常用。抗原捕获ELISA原理较为简单，主要是在固相上包被抗P24抗体，以捕获样品中的抗原成分，再用酶标记的另一抗P24抗体与被捕获得抗原反应，通过对酶催化显色的强度测定判断结果。

　　抗原检测实验可进行定量或定性检测，定量检测与定性检测的不同之处在于在定量检测时需要使用试剂盒给定的标准品进行梯度稀释，从而根据稀释度和检测结果(吸光度值)绘出定量曲线，将待测样品的检测值带入此曲线，进行定量。定量检测值通常用来作为表示病毒水平的指标。

　　作为辅助诊断进行定性检测时，阳性结果通常需要进行中和实验的确认。中和实验的试剂通常由同一厂家供给，其原理是通过加入中和试剂对标本进行前处理后再进行抗原检测，当处理后样品检测值下降到一定程度时(标准因试剂而异，常为50%)，可认为检测结果阳性成立。

　　体内抗原检测方法敏感性较低，检出率较差，目前在无症状期的感染者中检出率为10%，相关症状期的感染者检出率30%-40%，在发病期的病人中检出率也只有50%-60%。为提高检测敏感度，一些试剂使用了生物素-亲和素等信号放大系统，虽然使检测灵敏度有了一定提高，但检出率仍不尽人意。这是由于在通常情况下抗原会与体内的抗体结合形成复合物，使得可被体外捕获的抗原量减少，大大降低标准方法对抗原的检测率，因此发展了一类免疫复合物裂解测定试剂。使用调节酸碱度或加热的方法使复合物裂解，从而使得部分原来不可检测的P24抗原能够被检测出来。即使将复合物解离，敏感性提高，也只能在大约50%无症状感染者中检出P24抗原。 　　核酸检测
　　一、核酸检测方法
针对HIV核酸的检测包括对HIV病毒核酸RNA的检测和对HIV感染细胞核酸上整合的HIV核酸逆转录片断(cDNA)的检测。
　　二、RNA测定
　　HIV病毒RNA主要存在于病毒颗粒内，其定量测定主要反映了病毒存在的水平。病毒RNA的测定方法通常以定量为主，部分实验在定量方法上通过改变具备定性性能。

　　(一)RNA测定原理和方法
　　1.核酸序列依赖性扩增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)： 　　NASBA技术是一种等温扩增系统，其扩增基础在于系统内的混合酶系统，此系统内含有逆转录酶AMV-RT和T7-DNA多聚酶以在体外模拟逆转录病毒核酸体内复制过程。
　　扩增后的产物使用NASBAQR电化学发光(ECL)系统进行检测和定量，根据野生型病毒核酸测定值与其他3个内标物测定值的比较可得到野生型病毒的拷贝数。
　　生产厂家在此定量方法上通过改动设置可进行定性检测。

　　2.HIV-1定量检测逆转录PCR系统(RT-PCR)：
　　RT-PCR方法较为简单，基本原理是通过逆转录酶的作用将样品种RNA逆转录合成DNA后进行聚合酶链式反应(PCR)。
　　定量系统通过比较病毒核酸和QS的扩增产物量来完成，通过计算可定量病毒的拷贝数。

　　3.HIVRNA定量检测的分支DNA测定法(bDNA)：分支DNA测定技术基于其独特的信号放大系统，即分支DNA信号放大系统，这是一个人工合成的分支DNA，分支DNA的分支可结合多个酶标记物，从而将病毒的信号放大，以便进行检测。此检测系统不涉及核酸扩增反应。

　　(二)RNA测定的意义和应用
　　1.辅助诊断：在一般情况下HIV抗体检测足以对HIV感染与否做出正确诊断，但在特殊情况下单纯抗体检测不足以完成明确的判定，如出现某些非典型的抗体反应形式，特别是不确定反应时，RNA的测定可提供非常有用的证据。
　　2.早期诊断：在HIV感染的窗口期无法使用抗体检测进行诊断，而在感染早期，在抗原峰出现前后通常出现一个病毒载量的高峰，通常此高峰高于发病时的血浆病毒水平，并且有证据表明这个时期的病毒具有很高的感染能力。这个高峰在免疫系统产生反应后，尤其是在细胞免疫出现后开始下降。因此早期病毒RNA测定具有特殊的意义。
　　3.病程监控：根据感染发生后HIV病毒载量具有一定的变化规律，并且这种变化与疾病的进程有着密切的相关性，因此定期进行病毒载量的检测可以帮助医生和感染者确定疾病发展的阶段，以进行相应的治疗。 　　4.指导治疗方案及疗效测定：在进行抗病毒治疗后，只有通过病毒水平的检测才能确定此前的治疗是否有效，通常在治疗前后病毒水平降低0.5个对数级才被认为临床有效。临床实践证明，并非在任何情况下感染者都应该进行抗病毒治疗，这不但是经济上的原因，更重要的是由于抗病毒药物的副作用和疗效原因。通常在病毒载量达到一定的水平后(如＞35000-50000拷贝／ml)才进行抗病毒治疗。
　　5.预测疾病进程：HIV疾病进程与病毒载量的关系十分密切，观察感染者病毒RNA水平可大致预测其发病的可能。如下图所示，病毒载量与6年发病率的关系为：
病毒载量发病率
＜5005.4%
501-300016.6%
3001-1000031.7%
10001-3000055.2%
＞3000080%

　　三、DNA测定方法和原理
　　(一)PCR技术基本原理
　　PCR是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法，其特异性是由两个人工合成的引物序列决定的。所谓引物就是与待扩增DNA片段两翼互补的寡核苷酸，其本质是ssDNA片段。待扩增DNA模板加热变性后，两引物分别与两条DNA的两翼序列特异复性。此时，两引物的3'端相对，5'端相背。在合适条件下，由TaqDNA聚合酶催化引物介导的DNA合成，即引物的延伸。这种实验过程是在温度控制下进行的，一个变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环。PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复；延伸的产物经第二循环变性，亦与引物互补，作为引物引导DNA合成的新模板；因此，第二循环后延伸的模板由第一循环的4条增为8条，依次类推，以后每一循环后的模板均比前一循环增加一倍。理论上讲PCR扩增DNA产量是呈指数上升的。

　　(二)DNA扩增方法的分类
　　随着PCR技术和方法的发展和应用，许多PCR改良方法也相继出现，这些PCR改良方法主要与临床诊断和应用有关。目前使用的PCR改良方法主要有巢式PCR、复式PCR、逆转录PCR和定量PCR等。

　　(三)DNA检测技术在HIV检测中的应用
　　聚合酶链反应(PCR)是检测特定DNA片段非常敏感的方法。在诊断方面，DNA检测通常作为辅助性检测手段，在某些特殊情况下如非典型血清学反应、有临床症状／流行病学指标情况下的血清学阴性样品或新生儿感染时，DNA检测非常有用；在对感染者／AIDS病人进行临床观察或预后、HIV分型和变异研究等方面，DNA检测可作为常规手段。

　　1.对感染者／AIDS病人HIVDNA的检测：在临床治疗的病人中，部分临床抗病毒有效的病人病毒复制受到抑制，使用RNA检测很难奏效，而处于细胞内整合状态的病毒DNA则往往可以测到。部分长潜伏期(4-7年)病人，外周血中病毒RNA可长期处于很稳定的水平，但其病毒基因可能发生变异，而这些变异可能造成病毒毒力和感染性的变化，进一步引起感染者临床状态的改变，这些变化只能通过DNA分析被监测。

　　另外，对感染者PBMC中HIVDNA的定量检测可能作为临床预后的重要指标，因为相对于RNA检测来说，DNA检测对样品的处理和保存要求较低，同时方法的敏感性相当。

　　2.对血清抗体阴性和不典型血清学反应的DNA检测：通常情况下DNA检测不作为HIV感染的诊断手段，但考虑到HIV抗体检测的局限，尤其是在血清学窗口期，核酸检测效果可能优于其他种类的检测。通常在感染后3周左右出现抗体反应，但少部分感染者出现抗体的时间可能滞后到3-6个月。

　　DNA检测可缩短窗口期10天以上。在抗体出现的过程中，血清学反应可一度表现为不典型状态，部分感染者可能由于其他免疫缺损状态而出现免疫反应不全，也可能出现不典型反应，而在这些情况下病毒核酸往往表现出较高的可检测性，进行核酸检测较为有效。部分不典型血清学反应的样品可能是非特异反应，这时DNA检测可作为辅助排除感染的手段。

　　相对于抗原检测，DNA检测较为敏感；相对RNA检测，DNA检测的优势为对样品的适应性较好，最重要的是DNA检测更容易得到扩增的核酸产物，便于进一步进行分析。

　　3.新生儿HIVDNA的检测：HIV感染的母亲其婴儿由于母体抗体的存在，用抗体检测法常为阳性。但实际上只有20%-60%的婴儿受到HIV感染。因此，对这些婴儿进行HIV感染的早期诊断是十分重要的。PCR技术对被HIV感染母亲的新生儿和血清阴性儿童进行早期的直接的HIV-1检测是十分重要的。

　　PCR技术检测HIV-DNA序列对AIDS和ARC的确诊起着重要作用，但也有人认为对已知HIV抗体、抗原或培养阳性的病人不必再做PCR，最合适的PCR检测对象是那些疑有HIV感染但又缺乏确切的血清学依据的人群，如上述的HIV阳性母亲所生的婴儿、阳性患者的性伴侣、静脉吸毒者和可疑的血清反应者。PCR技术还可用来检测血液制品及疫苗中有无HIV。

　　四、序列测定和分析
　　艾滋病病毒的一个显著特点是其基因的高度变异性，使得在人群传播过程中产生变异，形成不同亚型的毒株，并且会在其特定的高危人群或地区中传播。在用抗病毒药物的治疗过程中，病毒基因也会引起变异，产生耐药株，使得病人继续用药无济于事。随着现代分子生物学的发展，序列测定成为解释变异的最准确的方法。因此，可以说序列测定对艾滋病病毒的检测和研究起到不可替代的作用。但是，由于该方法的费用昂贵，不易普及，限于篇幅，在此只作简单的介绍。有兴趣或有条件的读者，可查阅相应的书籍。 　　(一)DNA序列测定技术有两种：
　　(1)Sanger双脱氧链终止法。
　　(2)Nlaxam-GilbertDNA化学降解法。

　　(二)Sanger双脱氧链终止法测序技术的发展：
　　随着现代科技、计算机技术的高速发展及多学科的渗透，测序手段也从手动、半自动发展到全自动。仪器的改进大体上可以分成平板式序列测定仪和毛细管式序列测定仪。
　　1.平板式序列测定仪：该仪器采用光栅分光，CCD摄像机成像技术，实现多色荧光同时检测，与传统的滤镜及光电倍增管的检测方式相比，光栅及CCD的优势在于更新荧光化学时无需更换任何硬件设备。
　　2.毛细管式序列测定仪：20世纪90年代毛细管技术日趋成熟，平板式序列测定式向毛细管式序列测定仪发展。毛细管式序列测定仪与平板式序列测定仪相比较，其主要特点是采用毛细管代替平板灌胶。最大的特点是简便、快速，每个样品的电泳只需2h。20世纪末，人类全基因的测序就是依靠这种技术，在短时间内完成的。

　　(三)序列测定在艾滋病领域中的应用
　　序列测定方法已经是现代分子生物学的很重要的组成部分，是“后基因时代”研究的重要手段。
　　1.在基因变异方面的应用：新毒株的出现需通过DNA序列测定分析才能得以确认。
　　2.在耐药株检测方面的应用：对患者针对性用药将起指导作用。
对耐药株的检测方法很多，主要可分为序列测定和杂交检测两类。 　　T淋巴细胞亚群(CD4+、CD8+)测定
　　人类免疫缺陷病毒(HIV)感染人体后，细胞免疫功能受损，出现CD4+T淋巴细胞进行性减少，CD4+／CD8+T细胞比值倒置现象。如果进行HAART治疗，CD4+T淋巴细胞在病程的不同阶段有不同程度的增加。美国疾病控制中心(CDC)1993年修订的青少年和**HIV感染分类及艾滋病诊断标准，已采用了临床分型结合CD4+T淋巴细胞记数的分类方法。所以对CD4+T淋巴细胞数进行记数对于HIV／AIDS的分类、诊断和进展都是非常重要的。目前常用的检测CD4+和CD8+T淋巴细胞的方法有DY-NAL磁珠法和流式细胞术，在此不做详细介绍。