hiv确诊实验 免疫印迹法

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根据卫生部规定，HIV抗体阳性报告必须由卫生部认证并取得资格的艾滋病病毒抗体确认实验室出具才有法律效应。

最常用的HIV抗体确认实验方法是免疫印迹法(Wwstern  Blot,WB)

HIV抗体确认实验结果的评价  免疫印迹实验的结果是根据硝酸纤维素条膜特异性HIV抗原位置上出现的带型不同来判断HIV抗体为阳性、阴性和不确定。

　HIV抗体不确定(或可疑)结果的评价  在某些情况下，样品显示不典型的HIV反应性条带图谱，既不能确定为阳性也不能确定为阴性，称为HIV抗体不确定或可疑阳性。


[测定方法] 免疫印迹法（或蛋白印迹法）
[方法学原理] 将纯化的确诊HIV蛋白抗原裂解，然后通过SDS-PAGE按分子量大小将其分离，再转印至硝酸纤维素薄膜上，并保存于4℃干燥试管内，测定时将割成膜条的硝酸纤维素薄膜与待检样品反应，使其充分接触。若样品中含有HIV抗体，将会与膜条上的抗原区带结合，再加上酶标抗人IgG抗体，经过与底物反应显色，即可形成肉眼可见的不同区带。
[标本准备] 静脉抽血2ml，不抗凝。

[试剂]
1．转印有HIV I型和Ⅱ型抗原的硝酸纤维素薄膜
2．酶联结合物
3．底物及底物缓冲液
4．洗涤液
5．稳定液

[测定步骤]
1．在免疫印迹法反应槽内，加入3ml洗涤液。加入待测样品ul，混匀。
2．在反应槽内加入含HIV抗原的硝酸纤维素薄膜液，在室温环境中振摇2h，每份样品为l条。每次测定需附阴性对照、阳性对照。在振摇过程中，应使膜条带有号码的一面始终保持向上。
3．倾去槽内的反应液，用洗涤液将各膜条洗5次，每次3min。
4．在各反应槽内加酶联试剂，于室温环境中再振摇lh，用洗涤液洗4次，最后用底物缓冲液洗1次。
5．将底物溶液配好后，加入反应槽内并振摇数分钟，待阳性对照出现典型的HIV抗体阳性区带后，迅速倾去底物溶液，并加入稳定液继续振摇30min。然后将膜条取出，避光晾干，判断结果。
6．结果判断：确认试验的结果判定可根据世界卫生组织推荐的标准，即阳性至少1条env带和1条pol带；或至少1条env带和1条、gag带；或至少1条env带、1条gag带和1条pol带；或至少2条env带；阴性：无病毒特异带。可疑：1条gag带和1条pol带，或只有gag带或poi带。

[临床意义] 免疫印迹法是目前公认的确诊HIV感染的方法，若检出3个HIV主要基因（gag、poi、env）产物的抗体为阳性时，可确诊为HIV感染。

HIV属于逆转录病毒科慢病毒属中的人类慢病毒组,为直径约100~120 nm球形颗粒,由核心和包膜两部分组成。核心包括两条单股RNA链、核心结构蛋白和病毒复制所必需的酶类,含有逆转录酶(RT, P51/P66),整合酶(INT, P32)和蛋白酶(PI, P10)。核心外面为病毒衣壳蛋白(P24, P17)。病毒的最外层为包膜,其中嵌有外膜糖蛋白(gp120)和跨膜糖蛋白(gp41)。

HIV基因全长约9.8 kb,含有3个结构基因(gag、pol、env)、2个调节基因(tat反式激活因子、rev毒粒蛋白表达调节子)和4个辅助基因(nef负调控因子、vpr病毒r蛋白、vpu病毒u蛋白和vif毒粒感染性因子)。

HIV是一种变异性很强的病毒,各基因的变异程度不同,env基因变异率最高。HIV发生变异的主要原因包括逆转录酶无校正功能导致的随机变异、宿主的免疫选择压力以及药物选择压力,其中不规范的抗病毒治疗是导致耐药性的重要原因。

根据HIV基因差异,将其分为HIV-1型和HIV-2型,两型间氨基酸序列的同源性为40%~60%。目前全球流行的主要是HIV-1(本方案中如无特别说明,HIV即指HIV-1)。

HIV-1可进一步分为不同的亚型,包括M亚型组(主要亚型组)、O亚型组和N亚型组,其中M组有A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K11个亚型。此外,近年来发现多个流行重组型。HIV-2的生物学特性与HIV-1相似,但其传染性较低,引起的艾滋病临床进展较慢,症状较轻。

HIV-2型至少有A、B、C、D、E、F、G7个亚型。我国以HIV-1为主要流行株,已发现的有A、B(欧美B)、Bc(泰国B)、C、D、E、F和G8个亚型,还有不同流行重组型。

HIV通过各种途径进入机体后,病毒通过粘附,穿透细胞,复制等过程完成感染。此时检测抗-HIV常呈阳性。蛋白条带会出现gp 160、gp 41、gp 120、p 17、p 24、p 55、p 31、p 51、p 66。p 55抗原分子是一种前体分子,在HIV感染早期出现并渐渐地分解成其他核蛋白。gp 160是前体分子,在感染初期产生,然后分解成gp 120和gp 41。gp 41蛋白分布在病毒包膜的内外层(跨膜糖蛋白),与HIV-1分型有关。gp 41与gp 160共同参与病毒与宿主细胞CD 4分子变体的结合。在检测到gp 160和p 55时,说明病毒正在复制过程中。POL蛋白包括的p 66、p 51和p 31,POL蛋白位于病毒的核区内,与病毒核酸紧密相关联。病毒感染最初阶段,ENV(gp 160)或GAG(p 24)可单独出现,在感染初期30 d,p 24与gp 160的强度大约会相等,当病毒感染2~3个月时,ENV和GAG标记物饱和,gp 160在6个月时可饱和。随着时间的推移,病毒过了相对的/停滞期/,开始大量复制,这时出现典型蛋白条带。


当一个人最近处于血清学转型时期,很可能在测定时出现不典型的条带类型。处于低感染的人群,有可能出现/不确定/结果。有时/不确定/反应是由于HIV-2型的交叉反应所致,比如gp 120、p 60。有些与HIV-2型感染有交叉反应。个别HIV-1型感染也可出现。这是因为艾滋病的自然病种或其他的免疫缺陷所致。p 24和p 66的抗体会随着艾滋病的病程进展而降低。另外,患有恶性肿瘤的感染者和接受免疫抑制药物治疗的感染者也有可能不出现阳性反应。当出现/不确定/结果时,建议感染者3~6个月进行复检,或检测病毒核酸或p 24抗原,以作为辅助诊断。

当p 17出现时,常伴有p 24出现,仅p 17出现无临床意义。当单独出现p 68、p 56、p 40、p 34时,可排除HIV感染。对于反复冻融的血清,ELIAS法检测抗HIV常呈阳性,同时胶体硒快速诊断也呈阳性,而WB呈阴性结果。