HIV的实验室诊断

正确认识窗口期

HIV病原学简介
    艾滋病病毒(HIV)是带有包膜的RNA逆转录病毒，在分类上属于逆转录病毒科慢病毒属。HIV呈球形或卵形，直径100～130nm，由包膜和核心两个部分组成。包膜蛋白包括外膜糖蛋白（gp120）和跨膜糖蛋白（gp41），核心部分由核壳蛋白、两个相同拷贝的核酸基因组－RNA和酶类组成。CD4是HIV最重要的靶细胞，在CD4淋巴细胞内逆转录酶将RNA逆转录成前病毒DNA，接着整合到宿主细胞基因组DNA中，而后和细胞一起复制。
    1983年法国巴斯德研究院首次发现艾滋病病毒，成为HIV-1型。后来在西非又发现HIV-2型。HIV－1型根据编码包膜蛋白的env基因和编码壳蛋白的gag基因序列的同源性又分为三个组，M(main即主要组)、O组（outline即外围组）和N（new，or non－m，non－o 新组或非M或非M非O组）。M组流行于世界各地，为主要流行型，可分为A－J10个亚型，我国主要为B、C和E亚型，但同时也有A和F型的报道。O组也称为外围组，是后来发现的，在分子进化树上与M组相隔2株猴免疫缺陷病毒（SIV）。N组是最近才从两名喀麦隆病人分离到的，在系统进化树上，N组是既不属于M组，也不属与O组的新病毒。HIV-2型主要在西非流行，欧洲、北美等少数国家也发现少数HIV-2型，HIV-2型在基因结构上与HIV-1型有部分相似性，其抗原特异性与HIV-1型不同，两者的核心蛋白交叉反应强，而外膜蛋白交叉反应弱。HIV-2也选择性地侵犯CD4+T淋巴细胞，与HIV-1型相比，HIV-2型毒力弱，从感染到发展成为AIDS所需的时间也长得多。
    临床诊断标准
    HIV感染和艾滋病病人的临床诊断目前是以2001年中国卫生部公布《HIV/AIDS 的诊断和防治原则》为准。
    实验室诊断
    实验室的条件不仅应符合《全国艾滋病检测工作规范（2004年版）》中对检测实验室人员、建筑设施和设备等条件的要求，还应符合《实验室 生物安全通用要求》（GB 19489-2004）对II级生物安全实验室（BSL-2）的各项要求。
    HIV检测不同于其他病原微生物检测，要求十分严格，任何错误的诊断，包括假阳性或假阴性，都会对被检者产生十分重要影响，因此，HIV检测必须严格按照《全国艾滋病检测技术规范》（2004年版）进行，为了使检测结果达到尽可能高的准确性，检测策略包括筛查试验和确认试验，即先用敏感性高的方法进行初筛，初筛阳性的标本再用特异性强的方法进行确认，同时，为了减少检测的错误和误差，还要采取严格的质量保证、质量控制和质量评价措施。
    艾滋病检测最常用的样品是血液，包括血清、血浆和全血，唾液或尿液有时也可作为测试样品。
    实验室检测方法包括病原学检测和免疫学检测，前者包括病毒分离培养、病毒抗原检测、病毒核酸检测等，后者主要检测人体产生的特异性抗体。其中对病毒抗体的检测是最常规使用的方法，这不但是由于这类检测特异性、敏感性较高，方法相对简便、成熟，更重要的原因是HIV抗体在病毒感染后除早期短暂的窗口期外的整个生命期间长期稳定地存在并可被检测到。其他检测方法通常是在特殊的情况下开展，如在窗口期、婴儿诊断和抗体无法确定的情况下，可进行抗原或核酸检测，是作为抗体检测的验证和补充，以及作为预后判断和疾病治疗的疗效观察等。现将各种方法原理及特点分述如下：
    HIV抗体检测
    一、筛查试验
    开展HIV抗体检测的实验室，必须是经过当地卫生行政部门验收合格并批准设置的实验室。包括HIV抗体确认中心实验室、HIV抗体确认实验室、HIV抗体筛查中心实验室和HIV抗体筛查实验室。
    筛查所采用的试剂必须是经过国家食品药品监督管理局注册批准、批批检合格、在有效期内，HIV1+2混合型，经临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。
    HIV抗体筛查试验检测方法包括酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)，明胶颗粒凝集试验(gelatine particle agglutination assay，PA)，乳胶凝集试验乳胶凝集实验(1atex agglutination assay，LA)，各种快速检测试验(rapid tests，RT)，放射免疫试验(radio immunoassay)等 。
    目前在实际工作中较常用有酶联免疫吸附试验、明胶凝集试验和快速检测试验。最常用的方法为酶联免疫吸附试验，原理为：将HIV抗原包被到固相载体上，标本中的HIV抗体与包被的HIV抗原结合形成复合物，利用抗体的多价性，又与酶（HRP）标记的同类HIV抗原形成一个HIV抗原抗体酶标记的HIV抗原复合物，最后加入底物，在酶作用下，产生显色反应，加硫酸终止后呈黄色，在450/620nm双波长下测定光密度值，与标准进行比较，以判定标本的结果。
    随着对HIV感染者和AIDS病人抗逆转录病毒治疗的进展，及对无症状HIV感染者提供自愿咨询检测（VCT）的迫切需求，简便、快速的HIV检测方法（RT）被广泛应用。常用的主要有以下几种：
    （1）明胶颗粒凝集试验（PA）：PA是HIV血清抗体检测的一种简便方法，是将HIV抗原致敏明胶颗粒作为载体，与待检样品作用，混匀后保温（一般为室温）。当待检样品含有HIV抗体时，经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原-抗体反应，根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。PA试剂有两种，HIV-1和HIV-2抗原共同致敏的PA试剂（AFD HIV-1/2 PA），已经由我国食品药品监督管理局（SFDA）注册批准。
    （2）斑点EIA或称斑点ELISA（dot-EIA）：以硝酸纤维膜为载体，将HIV抗原滴在膜上成点状，即为固相抗原。加血清样品作用，以后步骤同ELISA。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。
    （3）斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验：与斑点EIA相似，也是以硝酸纤维膜为载体。区别在于不用酶标记抗体，而代之以红色的胶体金（或胶体硒）A蛋白，用渗滤法作为洗涤方法。试剂稳定，可室温长期保存,敏感性约相当于中度敏感的ELISA，适用于应急检测、门诊急诊个体检测。目前已有在国内被SFDA批准注册的国外进口试剂和国内产品。
    （4）其它快速筛查试验方法：家庭HIV检测（Home Access System）、艾滋病唾液检测卡等。
标本验收合格后，可用筛查试剂进行检测，如呈阴性反应，报告HIV抗体阴性；对呈阳性反应的标本，须进行重复检测。
    重复检测是对筛查呈阳性反应的标本用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的试剂重复检测。如两种试剂复测均呈阴性反应，则报告HIV抗体阴性；如均呈阳性反应，或一阴一阳，需送当地艾滋病筛查中心实验室检测，并尽可能重新采集受检者血液标本和原有标本一并送检。如仍为阳性或一阴一阳需送艾滋病确认实验室进行确认。
    目前国内已有进口ELISA试剂（如荷兰生物梅里埃HIV-1/2抗体检测试剂）可同时进行HIV-1、HIV-2及O亚型检测。
    二、HIV抗体确认
    HIV抗体确认试验需要在确认实验室进行，常用的检测方法是免疫印迹法（WB）、条带免疫试验（LIA）及免疫荧光试验（IFA），其中以免疫印迹法最为常用。
    免疫印迹法（WB）原理为：病毒裂解物抗原经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离,然后将分离后的抗原转移(印迹)到硝酸纤维薄膜上,采用类似ELISA的技术, 当样品中含有HIV抗体时,它和印迹在硝酸纤维薄膜上的病毒抗原相结合呈现肉眼可见的特异性带型。
    确认试验：免疫印迹试剂有HIV-1/2混合型和单一型。一般先用HIV-1/2混合型试剂进行检测，如果呈阴性反应，则报告HIV抗体阴性，如果呈阳性反应，则报告HIV-1抗体阳性，如果不满足阳性标准，则判为HIV抗体不确定。如果出现HIV-2型的特异性指示条带，还需要用HIV-2型免疫印迹试剂再做单一的HIV-2型抗体确认试验，呈阴性反应，报告HIV-2抗体阴性；呈阳性反应的则报告HIV-2抗体血清学阳性，如需要进行鉴别，还应进行核酸序列分析。如为不确定结果，应随访；随访时间以每3个月一次，连续2次，仍呈可疑或阴性反应则作阴性确认报告；如果在此期间发现阳性反应，则作阳性确认报告。
    HIV-1 P24抗原检测
    HIV-1 P24抗原检测的适用范围包括：（1）HIV-1抗体不确定或窗口期的辅助诊断。（2）HIV-1抗体阳性母亲所生婴儿早期的辅助鉴别诊断。（3）第四代HIV-1抗原/抗体ELISA试剂检测呈阳性反应，但HIV-1抗体确认阴性者的辅助诊断。（4）监测病程进展和抗病毒治疗效果。
    P24抗原的检测通常是采用ELISA夹心法，用已知抗体包被固相反应板孔底，加入待测血清，若血清中含有P24抗原则与包被抗体形成抗原-抗体复合物，再加入酶（HRP）标记的HIV-1抗体与抗原结合，加底物显色，在酶标仪上读结果。
    结果报告和解释：（1）HIV-1 P24抗原的阳性结果必须经过中和试验确认。（2）HIV-1 P24抗原阳性仅作为HIV感染的辅助诊断依据，不能据此确诊。（3）HIV-1 P24抗原检测敏感性30－90%，低于病毒载量检测，阴性结果只表示在本试验中无反应，不能排除HIV感染。（4）婴幼儿经过胎盘或哺乳从母亲获得的HIV抗体不能用于诊断是否经母婴传播感染HIV。在18月龄以前可以用多种不同的非抗体依赖性的检验方法对新生儿HIV感染进行辅助诊断，包括：HIV P24抗原检测、病毒分离培养、RNA或DNA测定。
    HIV核酸检测
    随着分子生物学技术在艾滋病实验诊断中的广泛运用，人类可直接在阳性者血液中检测病毒核酸。HIV核酸检测有定性和定量两类，前者用于HIV感染的辅助诊断，后者常用于监测HIV感染者的病程进展和抗病毒治疗效果。
    定性检测一般用血浆或血清样品使用逆转录PCR实验（RT-PCR），检测血细胞样品使用PCR方法，一般使用套式PCR方法扩增两轮，然后对产物进行电泳，与标准物比较以判断结果。
    定量检测常用的方法有RT-PCR方法，分支DNA杂交实验（bDNA），核酸序列扩增实验（NASBA）等，这些方法都是针对检测样品中的病毒进行核酸扩增，然后对产物进行分析以判断样品中病毒含量的多少。
CD4+和CD8+ T淋巴细胞检测
    T淋巴细胞是机体免疫系统内功能最重要的一群细胞，在正常机体内维持着机体的的免疫功能，HIV主要侵犯人的CD4+ T淋巴细胞，导致其数量和功能上缺陷，破坏机体的免疫功能，最终导致各种机会感染和肿瘤。因此，测定CD4+和CD8+ T淋巴细胞就能了解HIV感染者的免疫状态以进行疾病分期，根据分期的状况了解患者的病情发展，决定正常的治疗方案和药物疗效。
    其原理是采用病人的抗凝血，加入荧光染色剂对各种淋巴细胞群进行特异性染色，然后在显微镜或流式细胞仪上对各细胞群进行分析、计数。
    病毒分离培养
    人体感染病毒后，便会终生携带。HIV广泛存在于人体的淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、组织、血液和其他体液中，从这些材料中分离培养HIV，可以研究HIV在人群中的分布、变异和耐药情况，以指导防治工作。
    值得一提的是，从受艾滋病病毒感染到血液中可以测出艾滋病病毒的抗体，需要一段时间，这段时间称为窗口期。由于人体免疫应答的差异，窗口期4周～6月，一般45天左右。处于窗口期的艾滋病病毒感染者血液中虽然检测不到抗体，但血液、精液、阴道分泌物等体液中含有艾滋病病毒而有传染性。确定一个人是否染上艾滋病病毒时，通常都是化验血液中有无艾滋病病毒抗体，而不是检查血液中有无艾滋病病毒。如抗体检验呈阳性反应，表明这个人已受艾滋病病毒感染，如果检测结果为阴性反应，在排除窗口期的可能性以后可以确认为未被感染HIV。在窗口期内可以选择抗原检测、PCR等方法进行辅助性诊断。
    以上各种方法的各有优缺点，如分子生物学方法虽然比较敏感，但检测费用很高；同时，各项检测所需的设备和环境也各有不同，并不是所有试验室都能做所有的检测项目，求检者可以依据不同的目的选择不同的检测方法