HIV感染的主要检测方法

samsung001001 · 发表于 2009-5-2 23:25

目前检测HIV的方法有100多种，总体来说可以分为抗体检测和病毒检测两大类。病毒检测包括细胞培养(病毒分离)、p24抗原检测和病毒核酸检测。早期对HIV的诊断主要是通过血清学试验检测抗HIV的抗体,间接地诊断HIV感染。近几年，分子生物学方法不断被应用到HIV的检测中，HIV的实验室诊断方法取得了很大的进展，核酸检测已经成为了HIV实验室诊断的发展方向。

　　抗体通常是在感染后3～8周能够被检测出来。目前，大多应用双抗原夹心法，这种方法具有很好的灵敏性和特异性。抗体检测由初筛和确认试验组成，初筛试验呈阳性的必须进行确认试验。酶联免疫吸附分析(ELISA)方法有一定的灵敏度，且操作简单、快速，适合对大量样品的检测。因此，是目前临床通用的初筛检测方法。国际上有3种确认试验方法，包括免疫印迹试验、条带免疫试验及免疫荧光试验,目前以免疫印迹试验最为常用。

　　在窗口期，病毒抗体不能被检出，但可以检测到病毒相关抗原或分离病毒。抗原能够在个体感染后先于血清转化2～18 d被检测到。因此，在血清转化期通过检测p24抗原有着很大的优势，可以作为早期辅助诊断HIV感染的一种方法。

　　病毒培养是检测HIV感染最精确的方法。一般采取培养外周血单个核细胞(PBMC)的方法进行HIV的诊断。

　　病毒核酸检测通常是通过检测HIV RNA水平来反映病毒载量，具有很高的灵敏度，使用适时荧光聚合酶链反应(PCR)技术，能够在HIV感染的前2周检测到病毒核酸。病毒核酸检测方法可用于HIV的早期诊断，如窗口期辅助诊断、病程监控、指导治疗方案及疗效测定、预测疾病进程等。目前常用的测定方法有逆转录PCR实验(RT PCR)、核酸序列扩增实验(NASBA)、分支DNA杂交实验(bDNA)等。使用高灵敏度的适时荧光PCR技术，能够在HIV感染的前2周检测到病毒核酸。

　　2.1 HIV抗体、抗原检测

　　HIV抗体一般在人感染后几周逐渐出现,可延续至终生，血清学试验分为初筛和确认试验。最常用的初筛试验和确认试验分别是酶联免疫吸附试验和免疫印迹试验(WB)。常规实验方法：酶联免疫吸附试验、免疫印迹试验(WestBlot)、间接免疫荧光法(IFA)。快速检测方法：明胶颗粒凝集试验、斑点免疫结合试验、Ｐ24抗原的检测、分子生物学方法、RTPCR检测法、荧光实时PCR检测技术、支链DNA（bDNA）、连接酶酶促链式反应(LCR)、核酸序列依赖性扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)

　　2.1.1 酶联免疫吸附试验

　　ELISA法的基本原理是免疫反应物通过化学或免疫学的方法形成酶结合物，酶结合物能与待检样品中相应的抗原或抗体结合成为免疫复合物,然后加入酶底物,经酶的催化或水解作用,无色底物产生颜色,用肉眼、分光光度计观察结果。初筛用的HIV ELISA试剂目前已经发展到第四代检测试剂。第一代试剂主要以病毒裂解物或部分纯化的病毒抗原包被反应板,以检测血清中的抗体。由于包被的抗原不很纯,假阳性率较高。第二代试剂使用基因工程方法得到的重组抗原和合成肽包被反应板，由于纯化抗原的使用,特异性有了很大提高。第三代试剂使用双抗原夹心法检测抗体,进一步提高了敏感性。第四代试剂则在第三代的基础上进一步增加了P24抗原的检测,把HIV抗原和抗P24的抗体同时包被反应板,可同时检测血清中的HIV抗体和P24抗原。

　　2.1.2 免疫印迹试验

　　免疫印迹试验主要用于确认试验，基本原理是HIV全病毒抗原经过SDSPAGE电泳,将分子量大小不等的蛋白带分离开来,然后再把这些已经分离的不同蛋白带电转移到硝酸纤维素膜上。将此膜切割成条状,每一条硝酸纤维素膜上均含有经电泳分离过的HIV病毒抗原。将待检血清样品用稀释液稀释成1/100,再把它直接加到硝酸纤维素膜上,恒温震荡,使其充分接触反应,血清中若含有抗HIV抗体,就会与膜条上的抗原带相结合。加入抗人IgG酶结合物和底物后,即可使有反应的抗原抗体结合带呈现紫褐色,根据出现条带情况判定结果。有报告说，免疫印迹试验的特异性不是很好, 有大约2％的假阳性率，但免疫印迹试验依然是目前最常用的HIV确认试验。

　　2.1.3 免疫荧光试验(IFA)

　　基本原理为应用Ｈ9或HUT78培养细胞作为载体,用HIV感染细胞,该细胞内就会含有HIV抗原,将HIV感染的淋巴细胞涂于玻片上,固定，制备为抗原片,加入待检血清，待检血清中的抗 HIV抗体与抗原结合后,再与荧光素标记的抗人Ig结合,在荧光显微镜下可见到细胞内有黄绿色荧光。

　　2.1.4 明胶颗粒凝集试验(PA)

　　PA的基本过程是先将样品稀释,然后分别加入经抗原致敏的和未致敏的明胶颗粒,混匀后保温(一般为室温)。当血清中有HIV抗体存在时,经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原抗体反应,根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。PA操作简便,无需特殊仪器设备,适合对少量标本的检测。

　　2.1.5 斑点印迹试验(或免疫层析/或渗滤)

　　斑点印迹试验一般采用硝酸纤维素膜作固相载体, 用HIV抗原包被于固相载体,加入待测标本(可为血清、血浆、尿液和其他体液),一定温度反应后洗去未结合于固相载体上的标本,包被抗原和被检血清中抗体结合,用胶体金(或胶体硒)代替底物连接在葡萄球菌蛋白Ａ上,金标记蛋白Ａ具有与人Ig结合的能力,因而可与被捕获的HIV抗体结合。若样品中有HIV抗体,则薄膜上就会产生一桔红色斑点(或线条),一般3～10 min出结果,特异性较好, 较为适宜于偏远地区临床用血检测,但不适于城市地区的献血员筛查。

　　2.2 分子生物学方法

　　随着生物技术的发展,核酸检测得到了人们越来越多的重视,它可直接检查HIV RNA,可在发现血清学变化之前检测HIV感染,而且比Ｐ24抗原检测方法更灵敏。

　　2.2.1 多聚酶链反应检测法

　　PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成。

　　① 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93 ℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。

　　② 模板DNA与引物的退火(复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55 ℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。

　　③ 引物的延伸：DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成1条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性—退火—延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成1个循环需2～4 min， 2～3 h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。检测HIVRNA,需要先利用逆转录反应将RNA转录为cDNA，继而以cDNA为模板进行PCR扩增即可，这样的反应称为RT－PCR。

　　2.2.2 实时荧光定量PCR技术

　　实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

　　本技术的原理是使用荧光基团标记探针,5′端标记荧光基团R,3′端标记淬灭基团Q,在没有PCR扩增时,由于荧光基团和淬灭基团空间距离很近,使荧光基团被淬灭,不发荧光;而当PCR扩增时,引物与荧光标记的特异性探针同时结合在模板上,荧光标记的探针与模板的结合位置位于上下游引物之间,利用Taq酶的5′3′外切酶活性,将荧光探针水解,荧光基团被释放出来,由于在空间上与淬灭基团分开,则发出荧光。发出的荧光可以被荧光探头检测到,一边扩增,一边检测,这样就实现了“实时”检测。该技术不仅实现了PCR从半定量到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性强、自动化程度高、有效解决了PCR污染问题等特点。

　　2.2.3 支链DNA检测法——ｂDNA

　　ｂDNA是定量检测血浆中的HIV1型RNA的一种方法。bDNA是指人工合成的带有侧链的DNA片段,在其每个侧链上都可以标记被激发的标记物。将HIV的RNA通过离心从病毒颗粒中释放出来,然后用捕获探针1将其捕获到微孔中。捕获探针2与病毒RNA的另一部分特异结合,又与预放大探针结合。后者再与放大探针即bDNA探针杂交。两套靶探针分别与病毒RNA的pol基因的不同区域特异结合。在微孔中形成了HIVRNA寡核苷酸复合物。再加入1种化学发光底物孵育后可放大化学发光信号。通过发光强度来定量,因为发光强度与样品中HIVRNA含量成比例。bDNA不存在扩增物的交叉污染,这较PCR是一大进步。bDNA有数十个覆盖整个基因组的探针,可以方便地检测HIV某些变异株,但灵敏度不及PCR，提高bDNA灵敏度是一大难点。

　　2.2.4 核酸序列依赖性扩增法(nucleic acid sequence based amplification, NASBA)

　　NASBA是由一对引物介导的、连续均一的、体外特异性核苷酸序列等温扩增RNA的新技术。反应在 42 ℃进行 ,可在 2 h内将RNA模板扩增约 109倍。NASBA原理是提取病毒RNA,加入AMV逆转录酶、RNA酶Ｈ、Ｔ7RNA聚合酶和引物进行扩增。整个反应分非循环相和循环相:在非循环相中,引物Ｉ与模板RNA退火后在AMV逆转录酶的作用下合成cDNA,形成RNA

NA杂合体,随即RNaseH降解RNA,引物Ⅱ与cDNA退火, 在反转录酶作用下合成第2条DNA互补链。双链DNA可在T7RNA聚合酶的作用下,经其启动子序列起动而转录RNA，RNA又可在反转录酶的作用下反转录成DNA，进入循环相,对模板进行大量扩增。

　　2.2.5 转录介导的扩增技术(transcription mediated amplification, TMA)

　　TMA技术原理与NASBA基本一致，略有不同之处是TMA利用的是MMLV逆转录酶及T7 RNA聚合酶两种酶，MMLV逆转录酶既有逆转录酶的活性又具有RNA酶Ｈ活性。反应在 41.5 ℃进行 ,可在 1 h内将RNA模板扩增约 109倍。

　　2.2.6 连接酶酶促链式反应(LCR)

　　LCR是基于靶分子依赖的寡核苷酸探针相互连接的一种探针扩增技术，是继PCR后新发展的一种较有前景的体外扩增技术。它的原理就是由2段寡核苷酸单链DNA探针与目标序列杂交,当该2段DNA探针与没有发生突变的模板褪火后,如果2探针是紧邻的,中间没有核苷酸间隔,则可在连接酶作用下连接起来,连接以后的新链又可以作为模板,引导下一周期的连接产生新的子链。若连接区段发生核苷酸的碱基突变,则连接反应不能发生,扩增反应终止。

samsung001001 · 发表于 2009-5-2 23:33

目前，有些发达市已经开始尝试不在检测HIV抗体而直接检测HIV病毒，这意味着患者在二周之内将有望确诊，而不在免受“窗口期”的限制，即“分子生物学方法”

philip140986 · 发表于 2009-5-2 23:40

2# samsung001001 我25天35天43天三次检测的医院河南省人民医院是排名靠前的三甲医院，我的检测结果是不是更加准确呢？那个医院在2004年引进来的瑞士产辉煌之星全自动酶免分析仪算几代的酶联呢？我剧烈恐~~呜呜我适用于六周论吧？可以排除了吗？

samsung001001 · 发表于 2009-5-2 23:59

2004年引进来的瑞士产辉煌之星全自动酶免分析仪应该是第三代酶联
你可以排除了

寂寞时空 · 发表于 2009-11-16 00:10

快速检测方法（例：金标法）包被当中，是否包括抗原呢？

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