关于各位极端分子担心的HIV-N O型病毒的论文

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《关于HIV-1“O组”和“N组”检测问题的澄清》


      前些日子偶然在网上看到地坛医院吴焱医生在自己的个人网站写的关于HIV-1“O亚型”和“N亚型”以及“少妇一夜情”的文章，在网上一搜相关文章结果发现谣言满天飞。其实，对于HIV-1 N组的担心完全没有必要，因为从流行病学和病毒学的角度分析都是不太可能的。另一方面，HIV-1 O组（Group O）和HIV-1 N组（Group N）都是可以检测的，但是取决于采用的检测试剂以及检测的时间。我曾经和法国著名的病毒学家——法国巴斯德研究所（Institut Pasteur）的Fran?ois Simon教授交流过HIV-1 O组和HIV-1 N组的检测问题。Fran?ois Simon教授是HIV-1 N组病毒的发现者，并一直在非洲工作于HIV病毒学及检测研究的第一线，他也认为HIV-1的O组和N组应该是可以检测的。
又一年的“世界艾滋病日”又要到了，在这里我就此问题做一个详细的解释和澄清，同时将相关的医学、病毒学的参考文献也附上。就算贡献一份自己的力量吧。如果哪位感兴趣的话，请查询相关的科学文献。

1、为什么说担心HIV N组没有必要？
   这个问题可以通过流行病学和病毒学的研究这两个方面来解释。
（1）流行病学的研究
HIV-1 O组最早于1990年发现于非洲的喀麦隆，直目前为止也主要限于中西非，例如喀麦隆、加蓬、乍得等国家。相对于全球广泛传播的HIV-1 M组病毒，O组的感染率非常低。例如，即便在发现HIV-1 O组感染者最多的喀麦隆，Fran?ois Simon教授的研究结果表明，其感染率也仅仅为0.4%左右，而M组的感染率则达到了31.5%。HIV-1 O组病毒还偶尔零星发现于西方国家，如法国、美国、西班牙等，但总体极少见。美国于1996年和1997年发现了两例HIV-1 O组病毒感染，但这两位感染者都来自西非。迄今十多年过去了，最新的流行病学研究表明，美国仍没有发现新的HIV-1 O组感染病例。
HIV-1 N组病毒于1998年在喀麦隆被Fran?ois Simon教授领导的研究小组发现。但是，N组病毒极其罕见，到目前为止，公开文献可以找到的仅仅为12例，而且全部来源于喀麦隆。要知道，有非常多的科学研究小组在中西非国家特别是喀麦隆和加蓬进行大规模的血液筛查和病毒学研究，因此这些统计数据是非常可信的。
我们可以将这12例HIV-1 N组感染与感染禽流感致死的患者数目对比，立刻就会发现担心HIV-1 N组感染是多么的没有必要。
（2）病毒学研究
2005年，美国克利夫兰大学的研究小组发现HIV-1 M组病毒、HIV-2以及HIV-1 O组病毒感染人体T淋巴细胞的能力存在巨大的差异。他们将15株不同亚型的HIV-1 M组病毒、8株HIV-2病毒、6株HIV-1 O组病毒放在健康人捐献的血液中进行感染/竞争实验。实验结果表明，HIV-1 O组毒株在人体血液环境的繁殖能力比所有的HIV-1 M组毒株和HIV-2毒株低至少100倍，而大多数HIV-2毒株的繁殖能力也远远低于HIV-1 M组的毒株。这个研究结果有力地支持了流行病学的统计数据，正是HIV-1 O组病毒的传播能力和致病能力要比其它HIV病毒弱得多，才导致HIV-1 O组感染极为罕见。
从这个研究本身也可以推断出，HIV-1 N组病毒的传播感染能力肯定不会强于O组，否则，也不会N组病毒已经发现十年了，全球才发现12例感染病例。
2、为什么说HIV-1 O组和N组是可以检测的？
这个问题阐述起来非常麻烦，需要冗长的解释。在解释之前，先引用Fran?ois Simon教授领导的研究小组关于快速试剂（即人们常说的金标法）对于不同HIV变种检测可靠性的研究，这篇论文发表在2002年的《病毒学方法杂志》上。在评估试验中，Fran?ois Simon教授使用了9个HIV-1 O组阳性血样及若干HIV-1 N组阳性血样，考虑到HIV-1 N组阳性血样非常稀少，因此他们只检测了凝胶法和快速法试剂，而快速法就包括了我国普遍采用的雅培Determine试剂。试验结果表明，雅培Determine试剂检测出了包括所有的HIV-1 O组和N组等79种不同基因型的阳性血样，灵敏度为100%。
从分子生物学的角度看，HIV-1 O组病毒应该比HIV-1 M组和N组更难检测一些，因为O组病毒不同毒株之间氨基酸序列差异较大，尤其是包膜蛋白（env），很难找到合适的共有序列（consensus），而M组和N组病毒的氨基酸序列就相对保守得多。从基因序列数据库（Genbank）可以查到几个N组毒株的氨基酸序列，通过软件分析，可以发现它们之间的基因差异要比M组更小，这一点与雅培实验室的研究小组得到的结论是一致的。因此，我们有理由相信，HIV-1 N组是可以检测的。
科学地讲，任何试剂都不能说可以检测所有的HIV变种，因为现实中无法做到这样的测试。但是，迄今为止并没有发现一种HIV变种它无法被所有的甚至大多数试剂检测。这说明尽管HIV变异和重组很频繁，但并没有违反目前人们认识的规律。另一方面，从概率的角度看，不同试剂检测相当于独立事件，假设每种试剂的漏检率低于千分之一，那三种试剂检测同时漏检的概率就只有十亿分之一。想想看，可能有那么极端的情况出现么？当然，这种分析的前提假设是否合理需要讨论。
现在国外的第四代HIV试剂都普遍加入了HIV-1 O组的合成肽或者重组抗原，例如生物梅里埃（bioMerieux）、雅培（Abbott Laboratories）、伯乐（Bio-Rad Laboratories）等，其实国外很多第三代试剂也就包含了O组抗原。国内试剂在公开文献中很少看到关于其性能评估的研究，因此不是很了解，也无法评价。
从试剂的性能来看，这些著名公司的产品基本上都能够检测出所有的HIV病毒抗体，无论是HIV-1 M组、O组、N组还是HIV-2，这方面的研究论文和评估报告非常多，感兴趣的话可以参阅例如《临床微生物学杂志》（Journal of clinical microbiology）、《病毒学方法杂志》（Journal of virological methods）、《医学病毒学杂志》（Journal of medical virology）等相关论文。
这里给出我认为检测性能最为优异的几种试剂，它们有理由让我们相信其漏检率至少低于千分之一的假设是合理的：
（1）罗氏公司（Roche Diagnostics）的Elecsys HIV Combi
（2）雅培公司（Abbott Laboratories）的Architect HIV Ag/Ab Combo及AxSYM HIV Ag/Ab Combo
当然，还有其它很多试剂也是非常优秀的，例如生物梅里埃的Vironostika HIV Uniform II Ag/Ab、伯乐的Genscreen HIV Ag-Ab ULTRA等等。推荐上述几种试剂的理由是根据试剂的抗原选择、检测方法以及众多文献给出的性能评估综合的。上述的这几种试剂中除了Murex HIV Ag/Ab属于普通的酶免疫测定（EIA）外，其它都属于化学发光免疫分析，需要在专用的免疫分析仪上使用，像Elecsys 2010电化学发光全自动免疫分析仪、Architect i2000SR/AxSYM全自动免疫分析仪等。因此它们的测试成本要比普通EIA高得多。尽管如此，据我了解，好像国内很多医院已经采用了上述的试剂，但人们对此并不是很了解。后面我会详细解释HIV抗体检测理论上优异的抗原选择，并将普通酶免法与化学发光法做一个简单对比。

3、HIV抗体检测试剂的抗原选择——氨基酸序列及立体构像表位
当HIV进入人体并建立感染时，人体的免疫系统会对HIV的多种病毒蛋白产生相应的抗体。HIV抗体检测试剂可以采用env、gag 或者pol 病毒基因编码蛋白，例如包膜蛋白（env）gp160、gp120和gp41，核心蛋白（gag）p24、p17、p7和p9，聚合蛋白（pol）p32、p66、p51和p11。事实上，自从80年代HIV被发现开始，病毒学家就尝试采用上述各种结构蛋白作为HIV检测试剂的抗原。随着研究的深入，他们发现只有针对包膜蛋白的抗体会长期在人体内稳定存在，无论是HIV的初期感染者还是AIDS晚期病人，尤其是gp41诱导产生的抗体滴度高达一比三百万；而针对其它结构蛋白的抗体会在HIV感染者进入AIDS阶段时而逐渐消失，这可能与病人的免疫系统被严重破坏有关。同时他们还发现，包膜蛋白的抗体主要集中针对一些抗原决定簇（IDR），几乎所有（>99%）的HIV感染者都会对gp41的毒性T淋巴细胞（CTL）表位和半胱氨酸环结构（Cys-X-X-X-X-X-X-Cys）产生强烈的抗体反应。由于CTL表位和半胱氨酸环所在的区域是gp41蛋白中氨基酸序列非常保守的区域，而且HIV-1 M组病毒不同亚型之间也高度一致，因此，现在所有的HIV抗体检测试剂都包含这个区域的重组蛋白或者合成肽。
但是，随着更多的HIV亚型乃至O组及N组病毒被发现，人们发现在HIV检测试剂中仅仅包含B亚型的gp41 IDR会推迟检测到其它亚型病毒抗体时间甚至漏检。原因很简单，这些毒株的gp41 IDR与B亚型gp41 IDR的氨基酸序列差别较大，这一点HIV-1 O组尤为突出，O组病毒gp41的氨基酸序列与B亚型的共有序列（consensus）只有50%的同源性，不同O组毒株之间gp41氨基酸序列差异也比M组大得多。因此，病毒学家们认为在检测试剂中加入O组抗原是必须的，同时必须尽可能采用氨基酸序列更长的env抗原，以覆盖更多的表位。
HIV抗体检测试剂中抗原可以选择全病毒裂解物、化学合成的多肽以及重组蛋白。第一代试剂采用的HIV全病毒裂解物由于纯度较差，容易产生假阳性或假阴性，故现在试剂多采用合成肽或者重组蛋白。合成肽抗原的优点是易于纯化，特异性好，而且成本低，但由于其片段短，分子量小，可能会缺乏立体构像决定簇。另一方面，对于合成肽抗原而言，增加长度并不一定能够增强其与抗体的反应，原因可能在于稍长的肽在液体环境中更易形成不利于HIV抗体识别的立体构像。利用基因工程获得的重组蛋白抗原，成本相对要高，但是可以获得尽可能包括HIV基因组功能区的所有能引起机体强免疫应答的决定簇，而且其在液体环境中的空间构像与HIV结构蛋白非常相似。因此，那些国外大公司生产的第四代试剂都采用重组蛋白作为主要的检测抗原。
1997年，在《细胞》和《自然》这两个著名杂志中几乎同时公布了美国两个研究小组关于HIV-1 gp41胞外结构域（ectodomain）核心结构的研究成果。他们的研究表明，由三个HIV-1 gp41胞外结构域（三聚体）的N端肽和C端肽相互作用形成一个六股螺旋束（6-helix bundle）。这个研究结果为研发更多的HIV侵入抑制剂（entry inhibitor）药物提供了理论基础。另一方面，研究者们发现六股螺旋束结构本身也具有极强的抗原性。研究表明，在HIV感染者血液中由HIV六股螺旋束结构诱导产生的抗体滴度超过一比三百万。由于gp41胞外结构域的C端七肽重复区（C-heptad repeat）特别是N端七肽重复区（N-heptad repeat）在HIV-1 M组各亚型之间、HIV-1 O组之间高度保守，同时N组相应的氨基酸序列与M组也高度同源，因此，这种立体构像抗原也是一种极优的检测抗原。
前面提到的罗氏的Elecsys HIV Combi、雅培的Architect HIV Ag/Ab Combo、Axsym HIV Ag/Ab Combo以及拜耳的ADVIA Centaur HIV 1/O/2试剂的检测抗原设计中都充分考虑了六股螺旋束立体构像抗原，我认为，这也是它们检测性能极其优异的原因之一。
尽管HIV env抗原是作为HIV抗体检测的首选，但是env 毕竟是不同HIV毒株之间基因差异最大的区域，而gag基因、pol 基因则保守得多。特别是pol 区的整合酶蛋白（integrase），不同O组毒株氨基酸序列相同率达到了96%，而M组不同亚型和O组之间最大的差别也仅14%。以此为抗原，会在HIV-1 M组、O组、N组及HIV-2之间产生强烈的IgG交叉反应。因此，前面提到的试剂Murex HIV Ag/Ab Combination还采用了重组的整合酶蛋白抗原（p32），Elecsys HIV Combi还采用了重组的逆转录酶蛋白（p55/p61二聚体）、ADVIA Centaur HIV 1/O/2则采用了重组的核心蛋白（p24）以提高对不同亚型/组的检测能力。

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是不是就是说检测为阴性就可以排除感染了

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其余的就不要考虑了

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很对