病毒载量检测在艾滋病诊断中的应用

真是怕到不行了

【摘要】  
目的 研究病毒载量检测在辅助蛋白印迹（WB）实验结果为“HIV-1抗体不确定”样本诊断中的应用，以完善艾滋病确证实验。方法 对我省2003年至今部分HIV抗体确认实验为不确定样本进行病毒载量检测，对部分检测对象进行随访观察，分析WB结果为不确定者是否感染HIV。结果 23个不确定样本通过病毒载量检测有20人最终确认为HIV感染或艾滋病病人，3人未感染HIV，为非特异性抗体交叉反应。结论 对WB实验结果为HIV抗体不确定样本，可通过病毒载量检测来辅助确诊是否感染HIV，并通过流行病学调查及临床表现等辅助诊断手段发现出现不确定结果的原因，为及时提供检测后咨询和免费抗病毒治疗以及母婴阻断等措施提供实验依据。

    2003年,针对我国艾滋病防治的严峻形势,国家开始对艾滋病病人及感染者实行“四免一关怀”政策。享受“四免一关怀”政策的前提必须是诊断为艾滋病病人或感染者，但目前我国艾滋病的诊断主要是运用蛋白印迹实验检测血清或血浆中是否产生HIV抗体［1］，检测结果分为三种，“阳性”、“阴性”和“不确定”，“不确定”结果常常给医生决定是否进行抗病毒治疗以及孕妇是否进行母婴阻断等带来困扰，也给检测对象带来痛苦，如何尽早准确地判定检测对象是否感染HIV，是我们检测人员研究的方向。HIV病毒载量检测可定量检测HIV核酸，与抗体检测比特异更好，且HIV核酸在体内产生的时间比抗体早，此方法结合流行病学调查以及临床表现，运用于蛋白印迹实验中“不确定”结果样本的检测，可对受试者做出更准确的判断。
　　1  材料与方法
    1.1  样本  23份样本来自我省各筛查实验室筛查结果为阳性的样本。
    1.2  仪器和试剂  （1）蛋白印迹仪为新加坡GENELABS公司AUTOBLOT-SYSTEM36、Auto Blot20，半制动核酸提取仪为生物梅里埃NucliSens Mini MAG，病毒载量仪为生物梅里埃Easy-Q（374-2675G）。（2）所有批次WB确认试剂为MP生物医学亚太私人有限公司蛋白印迹试剂盒，均经过国家药品、生物制品检定所批检合格。（3）核酸提取试剂为生物梅里埃lysis buffer、magnetic extraction reagents试剂盒。（4）NASBA扩增试剂为生物梅里埃EasyQ HIV-1试剂盒。
    1.3  实验方法
    1.3.1  确证实验  蛋白印迹试验，过夜法，试验步骤及结果判定均参照试剂盒说明书，HIV抗体不确定的判定标准为出现任何病毒特异性条带，但不足以被判断为阳性。
    1.3.2  核酸提取  （1）将裂解缓冲液（lysis buffer）放置室温或37℃孵箱10min，使结晶完全融化，编上与样本对应的号，离心试管10s 1500g，分别加入200μl待测样本（如果是陈旧样本需振荡后离心取上清），震荡，15℃～30℃放置10min，离心10s 1500g。(2)枪头尽量靠近管底分别加入20μl内参（Calibrator）涡旋。(3)振荡带磁粉的硅胶悬浮液(Silica)，分别加入50μl硅胶悬浮液，即刻混匀，放置室温10min。(4)离心试管2min 1500g，弃上清。加400μl清洗缓冲液 1(Wash Buffer 1)，重悬沉积硅胶，移入标记好的1.5ml离心管。(5)以STEP1的速度于NucliSens mini MAG上清洗30s后，弃上清液。(6)用清洗缓冲液1重复洗1次。加入500μl清洗缓冲液2洗30s，2次。(7)加500μl清洗缓冲液3洗15s，弃上清。(8)加25μl洗脱缓冲液，放入恒温振荡器(1,400rpm)，（60±2）℃孵育5min。(9)将离心管放入磁盘，移核酸提取液到编好对应号的干净EP管作为模板，切忌取到硅胶颗粒。
    1.3.3  NASBA技术的核酸扩增［2］  (1)引物和酶先取出在室温放置5min。(2)取45μl酶稀释液（ENZdil）加入含酶（ENZ）的小球中（不能剧烈震荡，然后离心）。(3)取90μl引物稀释液（PRMdil）加入含引物和探针（PRM）的小球中（立即震荡，不可离心）。(4)稀释后的引物分装到上机管，每管90μl；酶加管盖上，每孔45μl，分别在管内加入5μl模板。(5)将加入模板的上机管放入孵育器，65℃孵育2min，41℃孵育2min。(6)盖上上机管管盖，离心（短暂），混匀，离心（短暂）。(7)放入孵育器，41℃孵育2min。(8)编程，上机运行，结果打印。
　　2  结果
    2.1  基本信息和WB实验结果  23份样本经WB确认实验，结果均为HIV-1抗体不确定，其中13份样本进行了2次以上WB确认。9号由于首次检测时自述除因血友病常输血外，无其他可能感染途径，我们在工作中发现和了解到个别3条带最后却变为HIV抗体阴性的情况［3］，慎重起见在结果判定上没直接判为阳性而是不确定，可后来时间跨度近8个月的2次随访检测条带均未出现任何进展，因而进行核酸检测。23份样本中性别分布：男15例，占65.22%；女8例，占34.78%。年龄分布：20岁以下2例，占8.70%；20～30岁（含20岁）7例，占30.43%；30～40岁（含30岁）8例，占34.78%；40岁（含40岁）以上5例，占21.74%。送检人群：自愿咨询检测者（VCT）5例，占21.74%；临床病人7例（临床病人主要表现为艾滋病机会性感染），占30.43%；孕妇2例，占8.70%；一般人群6例，占26.09%；其他3例，占13.04%（详见表1）。
    2.2  病毒载量检测结果、目前状况及可能感染途径  23份样本进行病毒载量检测，结果16份扩增出了HIV核酸，另外7份样本未检测到。7例临床病人HIV核酸均为阳性，载量水平在19 000～1 000 000IU/ml；5例VCT的HIV核酸也为阳性，载量水平在1 300～1140 000IU/ml；2例孕妇未检测到HIV核酸。从13例了解到感染途径来看，性传播11例，包括男男同性性行为（MSM）和异性性行为，占主导地位；另外2例为母婴传播和输血传播。为了证实判断结果的正确性，我们对部分能随访到并愿意接受检测的人进行了随访和检测，3例临床病人和1例婴儿已经死亡，另外4例WB条带已进展到确认足以判断为阳性，均与结合病毒载量检测结果做出的判断相吻合（详见表2）。 表1  四川省2003—2008年部分HIV-1抗体不确定结果信息登记表表2  不确定样本病毒载量检测结果及综合结果判定登记表
    3  讨论
    艾滋病由于其特殊性，漏诊和误诊都可能给感染者或筛查为假阳性的检测对象带来很大的痛苦，也可能对社会造成危害。晚期艾滋病病人或窗口期感染者被诊断为“HIV-1抗体不确定”时，无法享受国家的“四免一关怀”政策；尽快将“HIV-1抗体不确定”者区分为是否感染了HIV就显得尤为重要。基于NASBA技术发展起来的Easy-Q病毒载量检测，其灵敏度高［4］，由于针对检测HIV核酸所设计的引物非常特异，特异性达99.7%［5］，完全的成品试剂盒，人为影响因素非常小，结果非常稳定等特点是普通PCR所不能替代的，可用于帮助确定WB实验中的“HIV-1抗体不确定”结果。
    3.1  病毒载量检测可用于窗口期感染者的发现  从艾滋病病毒的动力学模式来看，窗口期感染者由于体内还没产生出足够检测出来的抗体，这时候却会出现病毒血症［6］，因此核酸检测可能发现窗口期感染者［7，8］。1号是我省首次运用病毒载量检测出来的窗口期感染者，也是当时全国首例VCT检测出来的窗口期感染者，该感染者自述暴露时间清晰，仅10余天就能检测出病毒载量。1号样本第1次进行病毒载量检测是2006年12月6日的样本，发现阳性后，再回顾性检测了其前2次样本，第1次样本检测结果为错误10，由于样本量太少，做完此次实验已将样本用完，无法进行重复实验，从扩增曲线来看有一条非常竖直的扩增曲线，而内参却未能扩增出来，Easy-Q有个检测范围，50IU/ml～300万IU/ml，分析原因可能是该样本已超过载量检测限。2号、6号、7号、16号和1号均是自愿咨询检测者，均是筛查阳性，确认为不确定，但载量检测结果都很高；1号、6号、7号随访检测发现其WB抗体确认条带现在已经进展为全带或足够判定为阳性，这几个检测对象应该是新近感染上HIV的，属于抗体产生，但不足以判定阳性。在平常工作中如果发现以VCT形式前来检测的对象要考虑其为窗口期或新近感染。病毒载量检测可以推广运用到一些重要行业中的HIV检测，比如血站、单采浆站等［9］。
    3.2  病毒载量检测可发现晚期艾滋病病人  艾滋病病毒主要攻击人体免疫细胞，最终导致免疫系统被破坏，免疫功能丧失。本次研究发现，一些感染者不知道自己已经感染上HIV，到了艾滋病晚期出现许多机会性感染，在医院进行检查HIV抗体筛查为阳性，这时进行WB确认实验，可能出现不确定结果，而且有的检测对象反复多次进行确认实验，结果均为“HIV-1抗体不确定”，这时感染者身体非常脆弱，就算把他们的机会性感染治好了，由于WB确认结果为不确定，病人无法获得免费抗病毒治疗，而且临床医生也会因为抗逆转录病毒药物的毒副作用和一些人剧烈的身体反应，不敢给病人随便使用抗病毒治疗药物，像这样的晚期艾滋病病人如果不能尽快确诊，并及时进行抗病毒治疗，他们的生命将很快终结。艾滋病发病晚期病毒载量会非常高，通过病毒载量检测可以辅助诊断是艾滋病导致一些机会性感染？还是因为其他疾病引起的类似艾滋病症状。3号、5号、9号、10号、11号、15号均是临床病人，WB确认为不确定，而载量检测结果均非常高。在对待这样的临床病人上，如果其具有典型临床症状，流行病学又支持，出现WB确认结果为不确定时候，就应考虑其已经到了艾滋病晚期，尽快进行载量或核酸检测以指导临床医生正确用药。
    3.3  载量检测可用于排除HIV假阳性抗体的孕妇  我国目前规定建卡孕产妇均需进行HIV检测，孕妇由于其所处时间的特殊性，尽快确诊是否感染了HIV显得非常重要，如果感染了HIV可能就涉及妊娠终止或母婴阻断，而未感染HIV却得到“HIV-1抗体不确定”结果也将导致孕妇在心理和生理上受伤害，也容易对胎儿造成影响。本次研究发现，2例WB结果为“HIV-1抗体不确定”的孕妇病毒载量检测均是阴性，结合流行病学资料，最终判定其为阴性。我省平常使用抗体检测，并追踪随访发现，孕妇可能会因为怀孕体内激素分泌等因素出现非特异性抗体交叉反应，本次研究结果表明，病毒载量检测可以对“HIV-1抗体不确定”结果的孕妇进行辅助诊断，以确诊或排除HIV感染。
    3.4  载量检测可应用于婴儿早期诊断  感染HIV的母亲生育的小孩，由于从母体带有HIV抗体，因此在18个月内进行抗体确认实验，就算得到阳性结果也无法判断其是否真正感染HIV，我国目前推荐的是如果不同时间2次核酸检测阳性就可以确诊其感染了HIV。本次研究发现，13号，其父母均为HIV感染者，他第1次检测时未满18个月，结果尽管为“HIV-1抗体不确定”，但未出具报告。第2次检测时已经满18个月，结果仍然是“HIV-1抗体不确定”，病毒载量检测为41000IU/ml，从而判断其已经感染上HIV。本计划3个月后再对其进行一次复查，结果该小孩一直不间断的生病最后死亡。
    3.5  载量检测也可用于普通人群非特异性抗体交叉反应的排除  18号～23号是我省HIV感染情况非常严重的地区普通人群检测中筛查结果阳性，WB确认为不确定的样本，从本次研究结果来看，在普通人群中也常常存在非特异性抗体的交叉反应，进行核酸检测可以用于辅助诊断［10］。
    3.6  一个值得关注的问题  随着社会的发展，人们的包容度不断提高，我国男男同性性行为逐渐增多，从本次研究结果来看，男男性行为较易造成HIV的传播。本次研究23人中MSM占21.74%，无论窗口期还是艾滋病晚期，确证结果为不确定的检测者同过载量检测最终结果均为阳性。MSM人群“HIV-1抗体不确定”样本感染HIV的可能性更大，该人群的艾滋病检测和控制需加大关注力度。
    综上所述，病毒载量检测可以替代普通PCR进行核酸检测，可以用于WB确认结果为不确定样本的辅助诊断，及时确定检测对象是否感染HIV，在艾滋病防治工作中发挥重要的作用。

真是怕到不行了

老婆加油，你没事的！！