人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染标志分为病毒标志、免疫标志和相关标志三大类。病毒标志是指直接从HIV感染者体内分离出病毒或检出HIV组成成分(抗原或核酸)。免疫标志是指HIV感染所产生的HIV抗原、抗体等免疫物质。相关标志是指HIV感染后与艾滋病病情进展有密切关系的某些标志，如CD4细胞、CD8细胞，β2微球蛋白、有关细胞因子等。这些标志的测定可为HIV感染及临床疗效的考核提供极为重要的诊断、治疗和预后指征。目前HIV抗体的检测是艾滋病实验室检测中最常用的方法，因为HIV抗体是患者感染HIV后最容易检出并且持续时间最长的免疫学标志，而且抗体的检测方法大多简便、经济，易于推广应用。 人体感染HIV后，血液中最先出现HIV抗原，然后很快消失直到疾病后期才重新出现。几周后出现IgM抗体并很快消失，此后,IgG抗体出现并一直存在。因此，HIV感染的实验室诊断以抗体检测为主，病毒及相关抗原的检测为辅。 初筛试验的要求是敏感性高，理论上要求达到100%，尽可能避免漏掉可能阳性的对象，相对来说，对特异性要求不是太严，允许有少量假阳性，这些假阳性可以通过重复试验和确证试验排除。 HIV抗体初筛检测的方法很多，如酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、明胶颗粒凝集实验(gelatine particle agglutination assay, PA)、乳胶凝集实验(latex agglutination assay, LA)、各种快速检测实验(rapid tests)、放射免疫实验(radio immunoassay)等。这些实验使用的抗原早期是完整病毒的裂解产物，称为第一代试剂，这种抗原常常由于含有宿主细胞的成分而出现假阳性反应，为了获得可接受的特异性而稀释标本使试剂的敏感性也有所下降，同时这种抗原制备和纯化都比较困难，危险性大。第二代试剂使用重组或合成多肽HIV抗原，选择与免疫反应相关的抗原决定簇，敏感性和特异性均有所提高，这类抗原制备也更为安全、容易、重复性好。应该注意的是重组抗原有时由于含有载体的组分而出现假阳性结果，多肽抗原由于缺乏合适的立体构象有可能使敏感性下降从而导致假阴性。使用重组或合成多肽抗原制备的双抗原夹心法试剂盒常常被称为第三代试剂，这种试剂可以检测针对HIV抗原的所有抗体亚类，包括IgG、IgA、IgM、IgE、IgD，同时不需要将标本过度稀释来保证特异性，因而具有较高的敏感性。第四代试剂除使用重组或合成多肽抗原外还包被了P24抗体，可同时检测抗原和抗体。 1．酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验（ELISA）是最常见的HIV抗体检测方法，它具有准确性高、价格低廉、判断结果有客观标准、结果便于记录和保存等优点，适合于大批量标本的检测，是献血员筛选和临床诊断最常用的方法。
（1）方法和原理：使用最多的ELISA方法是间接法，这种方法的原理是将HIV抗原包被到微孔板或其他固相载体上，如标本中含有HIV抗体，则抗体就会和固相载体上的HIV抗原结合，洗涤去除未结合的非特异性抗体，加入酶标记的抗人免疫球蛋白抗体与HIV抗体结合，形成HIV抗原－HIV抗体－酶标记的抗人免疫球蛋白抗体复合物，最后加入底物发生酶催化的显色反应，测定光密度值(optical density, OD)，与判断标准进行比较，就可以得出标本中HIV抗体是阳性或阴性的结果了。间接法使用的标记抗体通常是抗人IgG，为了提高敏感性有时也加入抗人IgM。这种方法的特异性由包被于固相载体上的HIV抗原决定，相对来说特异性不高，存在非特异性问题。
另一种常用的ELISA方法是双抗原夹心法，将HIV抗原包被到固相载体上，标本中的HIV抗体与抗原结合形成复合物，由于抗体的双价或多价性，它同时还能与其他抗原结合，加入酶标记的同一类HIV抗原分子时，后者就会与固相载体上的抗体结合，形成HIV抗原－HIV抗体－酶标记HIV抗原复合物，最后加入底物发生酶催化的显色反应，测定光密度值，与判断标准进行比较，就可以得知标本中HIV抗体是阳性还是阴性。 还有一种ELISA方法是竞争法。它的主要特点是酶标记抗体是特异性的HIV抗体。标本中的HIV抗体与酶标记HIV抗体竞争固相载体上的HIV抗原，操作时同时加入标本和酶标记HIV抗体，如标本中的抗体浓度高，酶标记HIV抗体就不能与固相载体上的HIV抗原结合或结合得很少，显色反应就较弱，相反，如标本中的HIV抗体含量很少或没有，大量的酶标记HIV抗体将与固相载体上的HIV抗原结合，显色反应就很强。因而在竞争法中，光密度值与标本中的抗体含量呈负相关关系。这种方法是将标本与酶标抗体同时加入，需时更短，另外这种方法具有较好的特异性。 （2）结果的判断：ELISA方法是根据临界值(cut off value, CO)判断结果的。临界值是将检测的阳性和（或）阴性对照的OD值代入厂商提供的计算公式计算出来的判断阳性和性结果的界值。对于间接法和双抗原夹心法，标本OD值与临界值的比值大于等于1（S／CO≥1）为阳性；对于竞争法，标本OD值与临界值的比值小于等于1（S／CO≤1）为阳性。 尿液艾滋病病毒（HIV－1）抗体酶联免疫诊断试剂盒（CalypteTMHIV-1尿液EIA）是酶免疫测定方法在体外检测尿液中HIV－1抗体。此法用于实验室辅助临床HIV感染诊断。在确定标本HIV－1抗体的结果之前，根据美国疾病控制中心推荐的HIV抗体的诊断步骤，此项检测重复阳性的标本，用卡里普特公司的剑桥生物HIV－1尿液Western Blot试剂盒进行确诊。 近年与血液检查相比，尿液检查有多种优点。在尿液中一般不存在HIV病毒。卡里普特公司的剑桥生物HIV－1尿液Western Blot试剂盒，可对于尿液EIA重复阳性标本做确认实验。 尿液艾滋病病毒（HIV－1）抗体酶联免疫诊断试剂盒（calypteTMHIV-1尿液EIA）是利用重组的HIV－1表面抗原在尿液中检测HIV－1抗体。微孔板的孔中包被gp160膜抗原。把尿液标本或对照与标本缓冲液一起加入孔中温育。如果标本中存在HIV－1膜抗原的抗体，它们将与孔中的抗原结合。标本缓冲液用来减低孔中其它蛋白及抗体对孔壁的非特异性结合。通过洗涤去除未结合的物质。然后加入碱性磷酸酶标记的羊抗人免疫球蛋白抗体并温育。酶联物与孔中结合到抗原的HIV－1抗体结合。洗涤去除未结合的酶联物，然后加入底物（p-NPP）。如标本中含有HIV－1抗体，酶将使孔内液体由无色变为黄色，颜色的强度与标本中抗体含量成正比。反应用EDTA终止，用酶标仪在405nm处测吸收峰而读取结果。 试剂盒中包括阳性及阴性对照，每板应做2个阳性对照及3个阴性对照，将阴性对照平均吸收值加0.18得到cutoff值，标本是通过与Cutoff值比较来判断是否为阳性或阴性。 第一次检测阳性标本应用同一标本再重复检测，如果重复检测仍为阳性，标本为重复阳性标本。重复阳性标本用卡里普特公司的剑桥生物HIV－1Wester Blot试剂盒进一步确认。 胶体金法检测HIV抗体是一种不需要任何仪器设备的血清／血浆检测法，它利用免疫层析分析原理来快速检测血清／血浆中是否含有HIV抗体，从而用于判断人体是否受到HIV1型／HIV2型病毒感染。
试剂盒采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析技术来定性检测血清／血浆中是否含有HIV抗体，试剂盒含有被事先固定于膜上测试区（T）的重组HIV抗原和质控区（C）的抗-protein A抗体。
测试时，血标本滴入试剂盒加样孔（S）内，血标本中的HIV抗体与预包被在膜上的protein A胶体金结合物反应。然后，混合物随之在毛细管向上层析，在测试区（T）与固定在膜上的重组HIV抗原反应。如果血清中含有HIV－1抗体或HIV－2抗体，在测试区内（T）会出现一条红色条带，表明是阳性结果。如果在测试区内（T）没有出现红色条带，则血清中不含有HIV抗体，表明是阴性结果。无论HIV抗体是否存在于血清中，混合物都会继续向上层析至质控区（C），质控区的抗Protein A与Protein A胶体金结合物反应出现一条红色条带。质控区内（C）所显现的红色条带是判定是否有足够血标本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。 明胶颗粒凝集试验(PA)是一种快速的HIV血清抗体的检测方法。先将样品稀释，然后加入包被抗原的明胶颗粒，混匀后保温(一般为室温)。由于操作方便，且无需特殊仪器设备，很适合于对少量标本的检测。当血清或血浆中有HIV抗体存在时，经HIV抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原—抗体相互作用，产生肉眼可见的凝集反应。 | 
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发表于 2009-4-19 17:55
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